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DIG In Situ Hybridization FAQ

ロシュ・アプライド・サイエンス

 

日本語FAQサイトを開設しました!約500のFAQを閲覧・検索できます。
下記のFAQも順次、このFAQサイトに移行していきますので、あらかじめご了承ください。

 
     
 

こちらは逐次更新しているDIG In Situハイブリダイゼーションページです。この他にNon-RI In Situ Hybridization FAQ集も発行していますので、あわせてご覧ください。

 
 
組織サンプル処理について
プローブ作成について
in situ Hybridizationについて
シグナルの検出について
その他
 
     
     
 
組織サンプル処理について
 
 
Question プロティナーゼK処理はどのように行いますか?
Answer プロティナーゼK処理は、ターゲット核酸を取り囲むタンパク質を除去するために必要な処理です。
対象とする組織(種類や年齢)や、その固定方法、使用するプロティナーゼKに応じて、処理濃度、時間、温度などを検討する必要があります。
核の周囲にのみシグナルが出る場合は、処理が不十分ですので、より強い処理を行う必要があります。ただ、処理を強くし過ぎると組織構造が破壊されてしまいます。それらを考慮して、最適な処理条件を決定する必要があります。
弊社の「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」や、類似組織を扱った論文などを参考にして下さい。
一般的に、TEバッファー中に1〜40μg/ml程度、37℃、10〜30分間で処理する場合が多いようです。
一般的にパラフィン切片では、凍結切片より長時間が必要です。
また、一般的にプロティナーゼKを用いるこの処理は、ペプシン等の他のプロテアーゼを用いて行われる場合もあります。
結合組織や肝臓組織などでは、コラゲナーゼやディスパーゼを用いる場合もあるようです。
これらに加え、コンドロイチナーゼで処理する方法もあります。
プロティナーゼK(溶液タイプ)
1.25ml 3115887
5ml 3115828
25ml 3115844
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/115887a.pdf
プロティナーゼK(凍結乾燥タイプ)
25mg 3115836
100mg 3115879
500mg 3115801
1000mg 3115852
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/3115836a.pdf
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization英語版
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/InSi_toc.htm
 
     
 
Question 組織の固定はどのように行いますか?
Answer 組織中のヌクレアーゼ類を速やかに不活化し、RNAやDNAの分解を防ぐために固定を行います。 固定が不十分だと、目的のRNAやDNAが分解されてしまい、シグナルが検出出来ない場合があります。 また、過固定では、プロティナーゼ処理時間が長くかかります。 固定液は、緩衝液で作られたホルムアルデヒドやパラホルムアルデヒド(PFA)溶液が一般的です。 大動物の組織では、組織を摘出し、目的の大きさに切り分けて、充分な量(固定組織の50倍量)の冷却した固定液に浸漬し最低16時間固定します。出来るだけ小さく、薄い組織(厚さ2mm以下)を固定してください。厚い切り出し組織では、固定液の浸透が不十分となり、部分的に固定が行われない場合があります。 小動物の組織では、全身の灌流固定後、目的組織を摘出し固定液に浸漬し16時間再固定します。 骨組織では、固定後にEDTA処理を行い、脱灰を行います。蟻酸やトリクロロ酢酸ではシグナルが検出できません。 採取時期が違う組織を一度に包埋処理する場合は、冷却した多めの70%エタノールに、固定後の組織を直接移し変えて保存することが可能です。数週間は、この方法で保存できます。 固定処理はサンプルに応じて様々ですので、ご使用のサンプルに類似したサンプルを扱った文献などを参考にご検討下さい。
 
     
 
Question 凍結切片とパラフィン包埋切片ではどちらがいいですか?
Answer パラホルムアルデヒド(PFA)固定パラフィン包埋が一般的で、安定した結果が得られます。 パラフィン切片作成の設備がない場合は凍結切片でも可能ですが、未固定組織の凍結切片は、組織中のRNA活性が問題となることがあります。速やかな凍結切片の作製と作成後の固定が重要です。 PFA固定組織では、ショ糖勾配を用いて、凍結して同じ処理をしても問題はありません。その場合、RNaseでショ糖勾配が汚染されないように注意して下さい。 また、アルコール・アセトン固定では凍結切片は出来ません。
 
     
 
Question 組織の包埋はどのように行いますか?
Answer パラフィン包埋が一般的です。 パラフィンブロックは、遮光して冷蔵庫に保管すれば最低でも数年は使用可能です。 パラフィン切片も、乾燥状態で同様に保存すれば、長期間保存できます。 その他に、樹脂ワックス包埋などがありますが、パラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋が最も安定しているかと思います。
 
     
 
Question パラフィン切片の脱パラフィンはどのように行いますか?
Answer キシレンによる脱パラフィン処理方法が一般的なようです。 包埋組織の形状などに応じて、処理方法は異なってきます。 「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」や関連文献などで、ご自身の使用サンプルに近い条件のプロトコールをご選択されてみてはいかがでしょうか。
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization英語版
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/InSi_toc.htm
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization日本語版
http://www.roche-biochem.jp/products/detail/detail_dig_m02.html
 
     
 
Question パラフィン包埋切片からのRNAは取れますか?
Answer 脱パラフィン処理を行ってから、RNAを抽出することが出来ます。 固定の方法や程度、固定してからの期間などで、RNAの残存率は変化しますので、ご注意下さい。 抽出方法などは、次の製品の添付説明書をご覧下さい。
製品名:High Pure RNA Paraffin Kit
製品番号:3270289
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/3270289a.pdf
 
     
 
Question パラフィン包埋切片からのDNAは取れますか?
Answer 脱パラフィン処理を行ってから、DNAを抽出することが出来ます。 固定の方法や程度、固定してからの期間などで、DNAの残存率は変化しますので、ご注意下さい。 抽出方法などは、次の製品の添付説明書をご覧下さい。
製品名:High Pure PCR Template Preparation Kit
製品番号:1796828
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1796828a.pdf
 
     
 
Question Proteinase Kは従来のものと、新製品のリコンビナントでは、何が違いますか?
Answer 抽出源が異なります。 従来品は糸状菌由来でしたが、新製品のリコンビナントは酵母由来です。 最適使用条件や、活性などのスペックは、両製品とも同じと考えております。 詳細は、製品説明書をご覧下さい。
Proteinase K(従来品)
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1964364a.pdf
Proteinase K, recombinant(新製品)
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/3115836a.pdf
 
     
 
Question 内在性酵素の不活化はどのように行いますか?
Answer バックグラウンドが高い場合は、内在性酵素の影響を考慮する必要があります。 一般的に、パラホルムアルデヒド(PFA)などで固定した組織は、内在性酵素の影響はほとんど問題になりません。 心配なときは、センス・プローブによるネガティブコントロールを作り、内在性酵素の存在の影響を調べます。 内在性PODは、1%H2O2で30分間、室温でインキュベーションすることで不活化出来ます。 内在性APは、検出基質溶液中にレバミゾールを1mM濃度で加えること不活化出来ます。 通常は、内在性APはハイブリダイゼーション中に不活化されますので、必ずしもレバミゾール処理が必要とも言えません。 アプリケーションに応じて、検討する必要があります。(レバミゾール:SIGMA T1512, L9756など)
 
     
 
Question アセチレーションは必要ですか?
Answer トリエタノールアミンによるアセチレーションは、プローブとターゲット組織の静電気的な結合を低減します。
 
     
 
Question 一般の病理組織でin situ Hybridizationは可能ですか?
Answer 生検組織など小さな組織は、通常の処理がなされたサンプルでも、in situ Hybridizationが可能なこともありますが、研究に最適化された条件での処理をお勧めします。 手術標本の場合は、大動物からの組織の処理と同様にします。阻血後の時間が長いサンプルでは、発現パターンが変わることがありますので、摘出後速やかな固定が必要です。
 
   
     
 
プローブ作成について
 
 
Question in situ Hybridizationに適したプローブ鎖長はどのくらいですか?
Answer 一般的なDNAやRNAプローブでは、400〜1000bpを推奨しています。 プローブ鎖長が短い方がin vitroトランスクリプションの効率が上がります。長すぎるとプローブの作製効率が悪くなります。 プローブ鎖長が長ければ、特異性が向上し、ハイブリダイゼーション速度は大きくなります。 他方、プローブ鎖長が短ければ、マトリックス状の組織への浸透力が高くなります。 オリゴヌクレオチドプローブは1本鎖ですから、再会合を防止し、その短さから組織への浸透力は最高です。 プローブ鎖長は、アプリケーションに応じて調整する必要があります。
 
     
 
Question アルカリ加水分解によるRNAプローブ鎖長の調節はどのように行いますか?
Answer 長すぎるプローブ鎖長は、プローブのターゲットへの浸透を妨げます。
出来るだけ、プローブの長さは、RNAプローブを転写合成するテンプレートのcDNA鎖長で調節して下さい。 しかし、アルカリ加水分解により、RNAプローブ合成後に鎖長を短くすることも可能です。 弱いシグナルしか得られないとき、RNA鎖長を短くすることにより、シグナルが改善することがあります。 プローブの長さは、加水分解処理時間でプローブ鎖長を調節します。 一般的に、500塩基程度を目標に処理時間を設定しますが、RNAプローブの鎖長はランダムに短くなります。 DIGラベルプローブは、一般的に加水分解されやすいことにご注意ください。
以下に操作方法を記載致します。
詳細は「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」の55ページをご覧下さい。
1. 1μgのRNAに等量のDEPC処理水と2倍量の炭酸バッファーを加え、60℃、10〜60分間インキュベートし加水分解します。インキュベーション時間は以下の式に基づいて計算します。ただし、最適なインキュベーション時間は実験的に決定する必要があります。炭酸バッファーを加えた後、わずか30秒で加水分解反応が始まることが確認されています。
2. 等量の加水分解-中和バッファーを加え、加水分解反応を停止させます。
3. 3倍量の予め冷却したエタノールを加え、RNAを沈殿させます。よく混和し、−70℃、30分間静置します。
4. マイクロ遠心機で、+4℃で15分間遠心します(13,000×g)。
5. エタノールを捨て、100μlの予め冷却した70%エタノールでペレットを洗浄します。
マイクロ遠心機で、+4℃で5分間遠心した(13,000×g)後、70%エタノールを捨てます。
6. ペレットを乾燥させ、100μlのDMPC処理水で再懸濁します。このプローブを直ちに使用しない場合には、−70℃で保存します。
7. 10μlの加水分解されたRNAを、臭化エチジウムを含む1%アガロースゲルで電気泳動し、プローブの長さを確認します。
必要な溶液の組成
・DMPC処理水:0.1%ジメチルピロカーボネートで処理した滅菌蒸留水
・炭酸バッファー:60mM Na2CO3、40 mM NaHCO3;pH 10.2
・加水分解-中和バッファー:3M 酢酸ナトリウム、1%(v/v)酢酸;pH 6.0
・エタノール:-20℃で冷却した無水エタノール。70%エタノールはこれをDMPC処理水で希釈したもの。
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/pdf/ISH_54-57.pdf
 
     
 
Question 最適なプローブ精製の方法は何ですか?
Answer 市販の核酸精製用キットやエタノール沈殿などで精製出来ます。
注意:有機溶媒(PCI抽出など)を使用してプローブ精製は行わないで下さい。DIG分子は有機層に分離され、ヌクレオチドは水層に分離されますのでプローブからDIG分子が外れてしまいます。
◆DNAプローブ精製用キット
製品名:クイックスピンカラムDNA G-50 (ハプテン標識プローブ用)
製品番号:100609
スイングバケット遠心機が必要です。セファデックス樹脂を利用して、未反応ヌクレオチドを除去し、72bp以上のDNAを回収します。同製品ラインナップにRI標識プローブ用製品がございますが、ハプテン標識プローブの精製にRI標識プローブ用カラムを用いた場合、標識ハプテンがカラムに吸着してしまうため、若干回収量が低下します。
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/0100609a.pdf
製品名:High Pure PCR Product Purification Kit
製品番号:1732668(50回精製用)
製品番号:1732676(250回精製用)
シリカマトリックスを利用したスピンカラムです。未反応ヌクレオチドや短鎖プライマーを除去し、100bp以上のDNAを回収します。
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1732668a.pdf
製品名:クイックスピンカラムRNA G-50
製品番号:100616
スイングバケット遠心機が必要です。セファデックス樹脂を利用して、未反応ヌクレオチドを除去し、72bases以上のDNAを回収します。
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/0100616a.pdf
 
     
 
Question RNAプローブ合成用のテンプレート調製はどのように行いますか?
Answer T7やT3、SP6などのRNA Polymeraseが含まれるベクターに挿入した後、平滑もしくは5'突出の切断端を作る制限酵素で直鎖化し、適当なRNA Polymeraseを用いてin vitroトランスクリプションを行います。
テンプレートになるプラスミッドは、高純度である必要があります。
in situ Hybridizationでシグナルが得られない場合や弱い場合は、テンプレートの設計、作成からやり直すとよい結果がでることがあります。
また、PCRプライマーにアダプターとしてプロモーター配列を組み込んでPCRを行うことにより、プロモーターつきのPCR産物を得ることが出来ます。このPCR産物をテンプレートとしてin vitroトランスクリプションを行うことも可能です。
注意:PCRによるテンプレートの作成では、SP6 RNAポリメラーゼは使用出来ません。SP6 RNAポリメラーゼはプラスミドテンプレート条件下でのみ、効率的なRNA合成を行います。
 
     
 
Question DNAプローブの合成はどのように行いますか?
Answer PCRによる合成方法、cDNA合成時にDIG標識ヌクレオチドを取り込む方法、ランダムプライムド法、ニックトランスレーション法、オリゴヌクレオチドテーリング法などがあります。
各プローブ合成方法は、それぞれ特徴を持っていますので、アプリケーションに応じた合成方法をご選択下さい。
PCRによる合成方法は、PCR DIG Probe Synthesis Kitの製品説明書をご覧下さい。
日本語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1636090j.pdf
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1636090a.pdf
ランダムプライムド法は、DIG DNA Labeling Kit、あるいはDIG High Primeの製品説明書をご覧下さい。
DIG DNA Labeling Kit
日本語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1175033j.pdf
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1175033a.pdf
DIG High Prime
日本語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1585606j.pdf
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1585606a.pdf
cDNA合成時にDIG標識ヌクレオチドを取り込む方法は、Transcriptor Reverse Transcriptaseの製品説明書をご覧下さい。
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/3531317a.pdf
 
     
 
Question RNAプローブの合成はどのように行いますか?
Answer in vitroトランスクリプションにより合成出来ます。
in situ Hybridizationに用いるプローブとして、最も一般的です。
詳細はDIG RNA Labeling Kit、あるいはDIG Northern Starter Kitの説明書をご覧下さい。
DIG RNA Labeling Kit
日本語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1175025j.pdf
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1175025a.pdf
DIG Northern Starter Kit
日本語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/2039672j.pdf
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/2039672a.pdf
 
     
 
Question DNAプローブの長期保存はどのように行いますか?
Answer -20℃保存で、少なくとも1年間は安定です。
経験的には、非常に長い期間(3年間まで)安定でした。
 
     
 
Question 取り込まれたジゴキシゲニン(DIG)が核酸の吸光度測定(260nm)に影響しますか?
Answer 影響しません。
OD260へのジゴキシゲンニン分子の影響は無視できるものです。
 
     
 
Question DIG標識RNA プローブの長期保存はどのように行いますか?
Answer RNaseフリー条件下での、-70℃保存で、少なくとも1年間は安定です。
 
     
 
Question 直接検出法で標識プローブの収量を評価する際に、取り込まれなかったDIG-dUTP が影響しますか?
Answer 影響しません。
取り込まれなかったヌクレオチドのほとんどは、フィルターに結合しません。
 
     
 
Question DIG標識ヌクレオチドのアルカリ安定性とアルカリ不安定性の違いは何ですか?
Answer アルカリ条件に対する安定性、不安定性は、DIGハプテンとヌクレオチド間の結合を表しています。アルカリ条件下で、この結合が安定か、安定でないかを表します。
アルカリ不安定なDIG標識ヌクレオチドは、メンブレンハイブリダイゼーション(サザンやノーザン)を行う際の、ストリッピング時に有効な仕組みです。in situ Hybridizationでは、どちらのヌクレオチドを使用して頂いても構いません。
 
     
 
Question PCR DIG Probe Synthesis KitのLabeling Mixは単品販売されていますか?
Answer 申し訳ございませんが、単品での販売は行っておりません。
DIG DNA Labeling Mixの希釈率を変更して使用することは可能です。
製品名:DIG DNA Labeling Mix
製品番号:1277065
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1277065a.pdf
 
     
 
Question 発色検出後のプレートは、どれくらいの期間保存出来ますか?
Answer 検出サンプルは、基本的に写真やデジタル画像として保存して頂くことになります。
検出色素や蛍光色素の褪色、核酸の分解などの可能性があるため、長期保存の過信は危険かと考えます。
 
     
 
Question 合成後のプローブはどれくらいの期間保存出来ますか?
Answer ラベリング反応後、少なくとも1年間は安定して保存できます。
ただし、凍結融解の繰り返しは、プローブにダメージを与えてしまいますので、小分け分注して保存してください。
RNAプローブ:-20℃、あるいは-70℃で保存します(エタノール中での保存をお勧めします)。
DNAプローブ:TEバッファーで懸濁して、-20℃で保存します。
 
     
 
Question プローブの濃度は、どのようしてに測定しますか?
Answer 合成したプローブで希釈系列を作成し、既知濃度のプローブと比較することにより検定します。
プローブ合成液の電気泳動などでも、プローブ合成量の推測は可能ですが、標識の程度を確認することが出来ません。
必ず、直接検出によるプローブ収量の検定を行って下さい。
検定方法の詳細は「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」の65ページ「IX. DIGラベルされた核酸の収量検定」をご覧下さい。
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 65ページ 英語版
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/pdf/ISH_65-70.pdf
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 65ページ 日本語版
http://www.roche-biochem.jp/products/pdf/dig/situ/4.pdf
 
     
 
Question T7 RNAポリメラーゼは他社より高いけど、特性に違いがありますか?
Answer 弊社の製品を含め、各社の製品は抽出方法や、抽出源などが異なります。
製品の可否については、テンプレートや反応条件にも依存しますので、性能の優劣は申し上げられません。
弊社のラベリング用酵素は、品質管理としてDIGラベリング反応の確認を行っております。
 
     
 
Question アルカリ感受性のDIG標識ヌクレオチドは、どの程度のアルカリ条件まで、耐性がありますが?
Answer pH 9.5程度までのアルカリ条件ですと、DIG-ヌクレオチドは強固に結合したままです。
pH 11.5を超えるアルカリ条件では、アルカリ感受性DIG標識ヌクレオチドは、DIGハプテンとヌクレオチドが分離されてしまいます。c
 
     
 
Question 3'エンドラベリングキットや3'テーリングキットには、2ndジェネレーションが発売されていますが、従来品とは違うのですか?
Answer 製品の使用方法や、スペックはまったく変更ありません。
キット構成品のターミナルトランスフェラーゼが、リコンビナントに置き換えられたため2ndジェネレーションとして販売しています。製品の使用回数、ラベリング効率などのスペックは同等ですので、従来品と変わりなくご使用頂けます。
 
   
     
 
in situ Hybridizationについて
 
 
Question ハイブリダイゼーションバッファーにDTTを添加する必要はありますか?
Answer ハイブリダイゼーションバッファーにDTTを付加する必要があるのは、35Sを用いたin situ Hybridizationの場合のみです。
一般的に、DIGを用いたin situ Hybridizationの場合は必要ありません。
35S標識を用いたin situ HybridizationではDTTを添加することでバックグラウンドを軽減できる場合があります。
35S標識はジスルフィド結合により、凝集を形成する可能性があるためです。
 
     
 
Question アセチレーションは必要ですか?
Answer トリエタノールアミンによるアセチレーションは、プローブとターゲット組織の静電気的な結合を低減します。
 
     
 
Question キャリアーDNAは必要ですか?
Answer キャリアーDNAは、バックグラウンドを低減させるために、非常に有効です。
一般的に、0.5〜1mg/ml程度の濃度でハイブリダイゼーションバッファーに添加することが多いようです。
製品名:Fish Sperm DNA
製品番号:1467140
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1467140a.pdf
製品名:パン酵母tRNA
製品番号:109495
説明書はありません。
製品名:ビール酵母tRNA
製品番号:109517
説明書はありません。
製品名:大腸菌tRNA
製品番号:109541
説明書はありません。
 
     
 
Question ハイブリダイゼーションバッファー中の塩濃度はハイブリダイゼーションに影響しますか?
Answer 1価の陽イオンは、核酸と静電気的に相互作用しますので、塩濃度を高くすることで、2本鎖間の静電気的な反発作用を低減させます。
2価の陽イオンは、2本鎖DNAの安定性を高くします。ハイブリダイゼーション時は2価の陽イオンを除去するか、キレートして下さい。
 
     
 
Question ハイブリダイゼーションバッファー中のデキストラン硫酸はなぜ必要なのですか?
Answer 硫酸デキストランは、水溶液中では非常に強く水和されます。巨大分子のプローブは水和する水分子を得られなくなり、水素結合を強く求めるようになります。
結果として、プローブ濃度を上げた状態と同じ条件となり、ハイブリダイゼーション速度は加速します。
 
     
 
Question プローブの長さはハイブリダイゼーションにどんな影響を与えますか?
Answer 溶液中でのDNAの再会合速度は(1本鎖の)鎖長の平方根に比例します。
従って、長いプローブを用いればハイブリダイゼーション速度は最大となります。
しかしin situ ハイブリダイゼーションでは、密なマトリックスである細胞や染色体中にプローブを浸透させる必要があるため、短いプローブが望まれます。
また、フラグメントの長さは、熱安定性にも影響します。
次の式は、ヌクレオチドの長さが変化した場合Tm値にどれだけ変化をもたらすかの関係を示したものです。
Tmの変化×n=500(n=ヌクレオチド数)
 
     
 
Question プローブ濃度はハイブリダイゼーションにどんな影響を与えますか?
Answer プローブ濃度は、最初の数塩基対が形成される(ヌクリエーション反応)速度に影響します。隣接する塩基対が次々に形成され、(ジッパーを閉じるように)お互いがぴったりと合致していきます。このヌクリエーション反応は、ハイブリダイゼーション速度を限定するステップになります。ハイブリダイゼーションのカイネティクスは二次反応であると考えられています[r = k2(DNA)(DNA)]。従って、プローブ濃度が高くなると、再会合率(再アニール)も高くなります。
 
     
 
Question 塩基のミスマッチはハイブリダイゼーションにどんな影響を与えますか?
Answer 塩基対のミスマッチは、ハイブリダイゼーション速度およびその結果生じるハイブリッドの熱安定性の低下につながります。
非常に類以したDNAシーケンスどうしの区別を最大限にするためには、極めて厳しい条件下でハイブリダイゼーションを行います(温度をTm-15℃にするなど)。
長いプローブの場合、パーセント(塩基ミスマッチの比率)あたりTmは平均して1 ℃ 低下します。オリゴヌクレオチドの場合、ミスマッチがあるとハイブリッドの安定性に極めて大きく影響します。このことは、点突然変異の検出原理の基本となっています。
 
     
 
Question ハイブリダイゼーションバッファー中のプローブ濃度はどのようにして決定しますか?
Answer プローブ濃度は、最初の数塩基対が形成される速度に影響します。
つまりハイブリダイゼーション速度(再会合率)に影響します。
プローブ濃度が高いと、再会合率は高くなります。
 
     
 
Question ハイブリダイゼーションバッファー中の陽イオンの役割は何ですか?
Answer 一価の陽イオンは核酸(主にリン酸)と静電気的に相互作用します。
塩濃度を高くすると核酸の2本鎖間の静電気的反発は減少します。
高い塩濃度では、核酸ハイブリッドはより安定します。
塩濃度が低い場合、Tm値や再会合率は劇的に変化します。
ナトリウムイオン濃度が0.4Mより高くなると、、再会合率や融解温度への影響はごく僅かとなります。
次の式は、GC含量と塩濃度(0.1〜0.2Mの範囲)からTm値を求める式です。
Tm=16.6logM+0.41×(GC)+81.5
Mは塩濃度(モル濃度)、(GC)はグアニジンおよびシトシンのモルパーセントです。
0.4M以上のナトリウムイオン濃度の場合は以下の式が成り立ちます。
Tm=81.5+0.41×(GC)
 
     
 
Question ハイブリダイゼーションバッファー中のEDTAの役割は何ですか?
Answer フリーの2価イオンの存在かでは、2本鎖DNAの安定性が高くなります。
ハイブリダイゼーション溶液から2価の陽イオンを除去してハイブリダイゼーションの妨げとならないようにするため、EDTAやクエン酸を加えます。
 
     
 
Question ハイブリダイゼーション温度はどうやって決定しますか?
Answer プローブ配列に依存しますので、プローブごとに検討する必要があります。
一般的にプローブ配列から算出されるTm値より、10℃ほど低い温度を設定します。
また、ハイブリダイゼーションバッファーの組成により、最適なハイブリダイゼーション温度は異なりますので、アプリケーションごとに検討して頂く必要があります。
 
     
 
Question 推奨するフォルムアミドはありますか?
Answer 脱イオン化したフォルムアミドを使用します。黄色を呈しているフォルムアミドは、必ず脱イオン化します。脱イオン化カラムは市販されています。
 
     
 
Question ISHにDIG Easy Hybは使えますか?
Answer 残念ながらお勧めできません。DIG Easy Hybを用いた場合、バックグラウンドが高くなる場合があります。
弊社では、in situ Hybridizationに下記のバッファーを推奨しています。また、様々な文献でもハイブリバッファーが紹介されていますので、参照して下さい。
◆100bp以上のプローブを用いる場合
・50%脱イオンフォルムアミド
・2×SSC
・50 mM NaH2PO4/Na2HPO4バッファー; pH7.0
 オプション
 ・1×Denhardt's溶液
 ・デキストラン硫酸5〜10%
 ・温度37℃
 ・ハイブリダイゼーション時間:5分〜16時間
◆合成オリゴヌクレオチドの場合
・25%フォルムアミド
・4×SSC
・50 mM NaH2PO4/Na2HPO4バッファー; pH7.0
・1 mM EDTA
・キャリアーDNA/RNA(各1mg/ml)
・プローブ(20〜200ng/ml)
・5×Denhardt's溶液
 ・温度:室温
 ・ハイブリダイゼーション時間:2〜16時間
 
     
 
Question Denhardt's溶液の組成は何ですか?
Answer 50×Denhardt's溶液の組成は以下のとおりです。
・1% 塩化ポリビニル
・1% ピロリドン
・2% BSA
 
     
 
Question RNaseAのDNase不活化方法は?
Answer 一般的には、10mg/mlストック溶液を100℃で、10分間煮沸するように指示しています。
ただ、弊社のRNaseA(製品番号:109142、109169)は1mg/mlのストック溶液を推奨しています。
DNaseの不活化処理は、以下の方法を推奨しています。
・RNaseAを1mg/mlの濃度で、[10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl]に溶かします。
・80℃で30分間インキュベートします。
・ゆっくりと室温に戻します(ヒートブロックなどでインキュベートした場合は、ヒートブロックの電源を切って、室温程度まで放置します)。
・分注して、-20℃で保存します(凍結融解の反復は避けて下さい)。
製品名:RNase A
製品番号:
109142
109169
製品説明書はありません。
 
     
 
Question 最適なプローブ濃度はどのようしてに決定しますか?
Answer 最適なプローブ濃度は対象とする配列や、組織に依存して異なります。
プローブ濃度を高くすると、シグナルは強くなりますが、それに伴ってバックグラウンドも高くなります。
プローブ濃度を低くすると、バックグラウンドは低くなりますが、それに伴ってシグナルも弱くなります。
類似した実験操作の文献などを参考に、経験的に設定する必要があります。
切片のISHでは、マニュアルに従って作製したcRNAプローブを、ハイブリダイぜーション溶液で10倍から80倍程度まで段階希釈をして、最適な濃度を簡便に決定することができます。多くの場合は、この濃度の中に最適な濃度があります。
 
     
 
Question ハイブリダイゼーションバッファーにtRNA、ニシン精子DNAのような核酸を加える必要性はありますか?
Answer 変性させた魚精子DNA、あるいは酵母由来のtRNAを、最終濃度50μg/mlに加える事をお勧めしますが、必ずしも加える必要性はありません。
DIGテイルド‐オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションに用いる際には、(プレ‐)ハイブリダイゼーション溶液に、100 μg/mlの Poly (A)と5 μg/mlのPoly(dA)を加える必要があります。これは、ターゲットDNA内の相補的配列に対し、テールの非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐためです。
コントロール反応用に、DIG Oligonucleotide Tailing Kit, 2nd generation内にはPoly(A)溶液が含まれています。1mlの溶液中10 mg/mlで溶解しており、100 ml のハイブリダイゼーション溶液の作成に十分量です。
Poly(A)溶液について:
Poly(A)は水中に10 mg/mlで溶解しており、100 ml のハイブリダイゼーション溶液の作成に十分量です。コントロールオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に使用して下さい。この場合、Poly(dA) を加える必要はありません。
使用目的:非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐため。
 
     
 
Question DIG Easy Hybの組成は何ですか。
Answer 申し訳ございませんが、社外秘となります。
成分として尿素が含まれます。
 
     
 
Question in situ Hybridizationにプレハイブリダイゼーションは必要ですか?
Answer プレハイブリダイゼーションを行うことにより、シグナルのコントラストと感度の増強が期待できます。
通常、プローブの入っていないハイブリダイゼーション溶液をかけ、2時間の処理を行います。
 
     
 
Question ハイブリダイゼーション後、切片の上にかけていたカバーグラスをうまく外せないのですが?
Answer カバーグラスをかけたまま、温めた洗浄液に入れ、はがれるのを待ちます。
カバーグラスではなく、パラフィルムなどでカバーすることも行われます。
また、50%フォルムアミドで外を湿らせた湿箱の中でハイブリすることもあります。この場合は、プローブをかける範囲をブロッカーペンなどで囲むこともできます。
 
   
     
 
シグナルの検出について
 
 
Question 内在性酵素アルカリフォスファターゼ(AP)やペルオキシダーゼ(POD)の不活化はどのように行いますか?
Answer 内在性PODは、1%H2O2で30分間、室温でインキュベーションすることで不活化出来ます。
内在性APは、検出基質溶液中にレバミゾールを1mM濃度で加えること不活化出来ます。
通常は、内在性APはハイブリダイゼーション中に不活化されますので、必ずしもレバミゾール処理が必要とも言えません。
アプリケーションに応じて、検討する必要があります。(レバミゾール:SIGMA T1512, L9756など)
いずれにしても、センスプローブによるコントロールをとり、シグナルの出方を比較する必要があります。
 
     
 
Question APからPODに変更する場合、問題はありますか?
Answer 一般的にDIG-AP-NBT/BCIPは、POD-DABより高感度と言われていますので、若干感度が落ちる場合が考えられます。
また、ISHにおいて、APからPODに変更した場合、バックグラウンドの問題が発生する場合があるようです。
前処理におけるプロティナーゼK処理やHCl処理を調節が必要になるかもしれません。
製品名:AP標識抗DIG抗体, Fabフラグメント
製品番号:1093274
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1093274a.pdf
製品名:POD標識抗DIG抗体, Fabフラグメント
製品番号:1207733
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1207733a.pdf
 
     
 
Question NBT/BCIPが赤茶けて発色するのですが、改善方法はありますか?
Answer NBT/BCIPはアルカリ条件(pH9.5付近)で青色に発色します。
発色反応時のバッファーが中性状態の場合、赤茶色を呈する場合があります。
発色が赤茶色を呈する場合は、NBT/BCIPを添加する前に、pH9.5の検出用バッファーで、ターゲットスライドを十分に濯ぎます。
また、より高感度を得るためには、NBTとBCIPを使用直前に混合します。
製品名:DIG Wash and Block Buffer Set
製品番号:1585762
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1585762a.pdf
製品名:NBT/BCIP, ready-to-use
製品番号:1697471
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1697471a.pdf
製品名:NBT/BCIP, stock solution
製品番号:1681451
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1681451a.pdf
製品名:NBT
製品番号:1087479(結晶)
製品番号:1585029(結晶)
製品番号:1383213(溶液)
説明書はありません。
製品名:BCIP
製品番号:760994
製品番号:1585022
製品番号:1383221
説明書はありません。
 
     
 
Question マルチカラー蛍光in situハイブリダイゼーションの場合の抗体は何がありますか?
Answer ◆第一プローブ:テキサスレッド標識ストレプトアビジン---ビオチン標識抗ストレプトアビジン---テキサスレッド標識ストレプトアビジン
◆第二プローブ:マウス抗DIG抗体---ヒツジ抗マウス抗体---AMCA標識ヒツジ抗DIG抗体
◆第三プローブ:ウサギ抗フルオレセイン抗体:FITC標識抗ウサギ抗体
製品名:マウス抗DIG抗体
製品番号:1333062
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1333062a.pdf
 
     
 
Question 抗DIGヒツジ抗体に交叉反応はありますか?
Answer カルデノイド化合物
Digitoxin 0.1
Gitoxin 0.4
Lanatoside C 0.1
Digoxin 64
Dihydrodigoxin 96
β-Mthyldigoxin 21
α-Acethyldicoxin 91
β-Acethyldicoxin 77
Digoxigenin 100
Digoxigenin-mono-digitoxide 138
Digoxigenin-bis-digitoxide 104
ノンカルデノイド化合物
Esrtradiol 0.002
Estriol 0.001
Teststerone 0.002
Progesterone 0.002
Prednisone 0.003
Cortisol 0.002
Canrenone 0.003
Proscillaridin 0.003
Methylproscillaridin 0.001
k-Strophanthin 0.1
Spironolactone 0.002
 
     
 
Question SSC溶液の組成は何ですか?
Answer 20×SSC溶液の組成は以下のとおりです。
・3M NaCl
・0.3M クエン酸ナトリウム
 
     
 
Question ファストレッドの検出波長は何nmですか?
Answer 検出波長:最大584nm(565〜620nm)
 
     
 
Question ローダミンの検出波長は何nmですか?
Answer 最大励起波長:555nm
最大蛍光波長:580nm
赤色を呈します。
製品名:テトラメチルローダミン-5-dUTP
製品番号:1534378
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1534378a.pdf
製品名:ローダミン標識-抗DIG抗体Fabフラグメント
製品番号:1207750
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1207750a.pdf
製品名:アビジン-ローダミン
製品番号:1975609
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1975609a.pdf
 
     
 
Question フルオレセインの検出波長は何nmですか?
Answer 最大励起波長:494nm
最大蛍光波長:523nm
緑色を呈します。
製品名:フルオレセイン-12-dUTP
製品番号:1373242
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1373242a.pdf
製品名:フルオレセイン-12-UTP
製品番号:1427857
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1427857a.pdf
製品名:フルオレセイン標識-抗DIG抗体Fabフラグメント
製品番号:1207741
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1207741a.pdf
 
     
 
Question テキサスレッドの検出波長は何nmですか?
Answer 最大励起波長:590nm
最大蛍光波長:615nm
赤色を呈します。
弊社での取り扱いはございません。
プロメガ社などから販売されています。
 
     
 
Question AMCA(アミノクマリン酢酸)の検出波長は何nmですか?
Answer 最大励起波長:399nm
最大蛍光波長:446nm
青色を呈します。
弊社での取り扱いはございません。
フナコシ社などから販売されています。
 
     
 
Question Cy3の検出波長は何nmですか?
Answer 最大励起波長:552nm
最大蛍光波長:565nm
赤色を呈します。
弊社での取り扱いはございません。
フナコシ社などから販売されています。
 
     
 
Question 染色後の組織の色褪せを防ぐ方法はありますか?
Answer NBT/BCIPシグナルはそのままでは有機系の封入(マウント)剤に封入することが出来ません。
通常は、NBT/BCIPで検出したサンプルには水溶性のマウント剤を使用して下さい。
また、NBT/BCIP発色後、スライドグラスを蒸留水に軽く通し、ドライヤーの冷風で完全に乾燥後、キシレンに透徹すれば、有機系の封入剤が使用できます(乾燥は完全にしてください)。
シグナルは徐々に弱くなりますが、暗所に保存すれば数ヶ月以上は観察可能です。
他の基質については、以下を参照して下さい。
BMパープル:水溶性マウント剤
BCIP:水溶性マウント剤
ファストレッド:水溶性マウント剤
DAB:有機性マウント剤
 
     
 
Question シグナルの増感方法はありますか?
Answer 一般的に、チラミド(ダコ社)や、ポリビニルアルコール(PVA)が多く使われています。
PVAを用いた増感法については、「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」の172ページに記載されていますので、ご参照下さい。Whole Mount以外では、あまり増感出来ないようです。
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 172ページ 英語版
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/pdf/ISH_172-177.pdf
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 172ページ 日本語版
http://www.roche-biochem.jp/products/pdf/dig/situ/53.pdf
 
     
 
Question 免疫検出との2重染色は出来ますか?
Answer もちろん可能です。
ただし、プロテアーゼ処理は、組織のタンパク質分解が強力であり、免疫染色を弱くします。また、免疫染色は、NBT/BCIP発色反応を薄くします。
免疫染色の発色がDABであれば、先に免疫染色を行っても、in situ Hybridization処理過程後でもDABの発色は残ります。
ISH前に免疫染色を行っても、RNAのシグナルは弱くなりません。
(一次抗体が血清そのものであるときも大丈夫かといわれると自信がありません。)
複数の発表がありますので、ご参考にして下さい。
弊社発刊のバイオケミカニュースにも、2例の記載がありますので、ご参照下さい。
大腸癌組織におけるin situ Hybridizationと免疫染色の二重染色
バイオケミカニュースNo.96
http://www.roche-biochem.jp/biochemica/bionews_files/no_96/r_96_5.html
DIG標識RNAプローブによる心臓血管系凍結切片でのmRNAの検出
バイオケミカニュースNo.96
http://www.roche-biochem.jp/biochemica/bionews_files/no_90/r_90_5.html
 
     
 
Question バックグラウンドが高い場合は、どうすればいいですか?
Answer  様々な原因が考えられますので、実験ステップを確認する必要があります。
・プローブの配列特異性を確認します。
 サザンブロットやノーザンブロットで、プローブの特異性を確認します。
 またプローブ鎖長についても確認して下さい。
・プローブの濃度を確認します。
 合成したプローブをメンブレンに滴下して、直接検出法にてプローブ濃度を確認します。
 確認方法は「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」の65ページをご覧下さい。
 DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 65ページ 英語版
 http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/pdf/ISH_65-70.pdf
 DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 65ページ 日本語版
 http://www.roche-biochem.jp/pdf/products/dig/situ/4.pdf
 電気泳動などでもプローブ合成については確認出来ますが、プローブのらべリング効率を確認するためには、必ず直接検出法でラベリング効率の確認を行います。
 一般的には、プローブの濃度を低くすれば、バックグラウンドは減少します。
・ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度を確認します。
 プローブの配列から、最適なハイブリダイゼーション温度を算出します。
 バックグラウンドを低くするには、ハイブリダイゼーション温度もしくは洗浄温度を上昇させます。
・洗浄条件が適当か確認します。洗浄液内の塩濃度を変えてみてください。
・洗浄中のRNase A処理を追加することにより、バックグラウンドを低減することができます。ハイブリダイズしていないプローブを消化します。
・プローブをカラム精製します。
 プローブ溶液中に、短い鎖長の標識ヌクレオチド鎖が存在しますと、非特異的な結合を引き起こす可能性があります。
 DIG標識ヌクレオチドの精製には、次の製品をお勧めします。
 製品名:High Pure PCR Product Purification Kit
 製品番号:1732668
 英語製品説明書:
 http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1732668a.pdf
 製品名:Quick Spin Column G-50(ビオチン標識DNA用)
 製品番号:100609
 英語製品説明書:
 http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/0100609a.pdf
 製品名:Quick Spin Column G-50(ビオチン標識RNA用)
 製品番号:100616
 英語製品説明書:
 http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/0100616a.pdf
・洗浄用バッファーの温度や塩濃度を最適な条件にします。
 バックグラウンドを低くするには、洗浄温度を上昇させたり、塩濃度を下げたり、洗浄時間を延長する必要があるかもしれません。
 洗浄液はウォータバスであらかじめ1時間以上加温してください。温度上昇が不完全な可能性があります。
・抗体が非特異反応していないか確認します。
 ハイブリダイゼーション処理していないターゲット組織に、抗体を反応させ検出反応を行います。
 もし発色シグナルが検出された場合、抗体がターゲット組織と交叉反応を起こしている可能性があります。
 抗体がターゲット組織と交叉反応を起している場合は、ブロッキング条件を変更するか、標識ハプテンや検出用抗体を変更する必要があります。
・抗体が塊を形成していないか、確認します。
 抗体溶液は、抗体のダマを含んである場合があり、それが検出系に混入した場合、スポット状のバックグラウンドを生じる場合があります。
 抗体は、使用前に、10000rpmで5分間遠心し、その上清を使用します。
・基質がターゲット組織内在性酵素と反応していないか確認して下さい。
 ハイブリダイゼーションと検出用抗体処理を行っていないターゲット組織に、発色基質を加えて、インキュベートします。
 もし発色シグナルが検出された場合、発色基質がターゲット組織内在性の酵素と反応していることを示します。
 検出系を変更するか、内在性酵素の不活化処理を行う必要があります。
・ターゲット組織を貼付したスライドガラスに汚れがないか確認します。
 新しいスライドを使用し、使用する直前に洗浄する必要があるかもしれません。
・抗体反応、発色反応の時に、切片が乾燥気味になっていないか確認してください。
 これらの反応は蒸留水で湿らせた湿箱で行います。
・スライス切片に凹凸や、浮き上がった部分がないか確認します。
 不均一なターゲットを用いた場合、ハイブリダイゼーションや洗浄条件が一定とならず、所々にバックグラウンドが生じる場合があります。
・ブロッキング溶液の組成を変更することで、バックグラウンドを解消できる場合もあります。ブロッキングバッファーの組成成分自体を変更したり、濃度を調節を試みます。
・アセチレーションを行います。
ターゲット組織とプローブの静電気的な結合を減らします。
 
     
 
Question シグナルが弱い場合は、どうすればいいですか?
Answer 様々な原因が考えられますので、実験ステップを確認する必要があります。
・プローブの配列特異性を確認して下さい。
 サザンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションで、プローブが確実にターゲットを捕らえていることを確認します。
・プローブの濃度を確認します。
 合成したプローブをメンブレンに滴下して、直接検出法にてプローブ濃度を確認します。
 確認方法は「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」の65ページをご覧下さい。
 DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 65ページ 英語版
 http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/pdf/ISH_65-70.pdf
 DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 65ページ 日本語版
 http://www.roche-biochem.jp/pdf/products/dig/situ/4.pdf
 電気泳動などでもプローブ合成については確認出来ますが、プローブのらべリング効率を確認するためには、必ず直接検出法でラベリング効率の確認を行います。
・酵素標識抗体や発色基質が、活性を持っていることを確認します。
 プローブの濃度確認と同時に行えます。
・抗体の濃度が適当か、確認します。
 プローブの濃度確認と同時に行えます。
・基質の濃度が適当か、確認します。
 プローブの濃度確認と同時に行えます。
・ターゲット組織に、目的の核酸が存在することを確認します。
 同組織から核酸を抽出し、サザンブロットやノーザンブロットでハイブリダイゼーションすることを確認します。
 発色シグナルが得られない場合は、目的とする核酸が含まれていないことを示します。
・ターゲット組織に、プローブや抗体が浸透することを確認します。
 ハウスキーピング遺伝子などのプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行います。
 発色シグナルが検出できた場合、ターゲット組織に核酸が存在し、各ステップが順調に進められていることを示します。
 発色シグナルが検出できなかった場合、ターゲット組織に核酸が存在しないか、組織中にプローブや抗体、発色基質が浸透しないなどの要因が考えられます。
大型の分子に対するin situ Hybridizationでは、数箇所の部位のプローブを混合したプローブを用いると確実にシグナルは増強され、特異性が増します。
 
     
 
Question カウンターステイン(対比染色)は何を使えばいいですか?
Answer 容易にプローブ検出色と対比できる色を、ご選択下さい。
蛍光染色ではDAPI(青)、通常の染色では、メチルグリーン(緑)、ヘマトキシリン(青紫色)、ヌクレアーファーストレッド(赤)を用いることが多いようです。
製品名:DAPI
製品番号:236276
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/0236276a.pdf
 
     
 
Question 10%ブロッキングストック溶液を沸騰させる事は出来ないのに、なぜオートクレーブする事は推奨するんですか?
Answer ブロッキング試薬を一旦溶液に溶解させてしまえば、凝集は起こりません。
オートクレーブを推奨するのは、DMPC/DEPCの不活性化と10%ストック溶液の滅菌のためです。
オートクレーブ滅菌済ストック溶液は、室温(未開封のもの)や+4℃(開封後のもの)保存で、数日から1週間、また-20℃保存(分注してるもの)で、6ヶ月まで保存できます。
 
     
 
Question ブロッキング試薬(Cat.No.1096 176、粉末タイプ)はどのように溶解しますか?
Answer 調製方法:
1.10gのブロッキング試薬に100mlのマレイン酸バッファーを加える。
2.a.ホットスターラーで60℃、1時間または溶液に完全に溶解するまで加熱する。必要に応じて、加温温度を上げること。
または、
b.電子レンジで30秒間、数回(トータルで3〜4分間)加熱する。
3.細胞培養の培地等をオートクレーブするのと同様の条件でオートクレーブ滅菌する。
※注記:ブロッキング試薬がマレイン酸バッファーに完全に溶解するまで、時間をかけて溶解させなければいけません。沸騰させると試薬の凝集が生じるので、溶解の際、沸騰させなよう注意して下さい。ブロッキング試薬が溶液に完全に溶けない場合、溶液のpHをチェックし、必要に応じてpH調整を行い(中性域)、再度加温して下さい。
 
     
 
Question ブロッキング溶液はどのような形状ですか?
Answer 白色から淡黄色の懸濁液です。
 
     
 
Question 推奨しているマレイン酸は何ですか?
Answer Serva社(Cat.No.28337)やSigma社(Cat.No.M0375)から販売されているものをご使用下さい。
 
     
 
Question ブロッキング試薬(#1096 176、粉末タイプ)の組成は何ですか?
Answer 弊社の本試薬は、酢酸(pH 4.6)で沈殿させ、続いて 0.1 M NaOH中でミルクプロテインを可溶化して得られたノンファット・ドライミルク由来のカゼイン分画から成ります。
また、本製品にはRNaseが含まれるので、必ずストック溶液や希釈バッファーはオートクレーブ滅菌して下さい。
 
     
 
Question DIG Easy Hyb Granulesには何グラムの粉末が含まれますか?
Answer 1ボトルに46グラム入っています。
ただし、粉末を計量して2回以上に分けて溶解することは避けて下さい。
1ボトルで調製した溶液と異なる組成になることがあります。
in situハイブリダイゼーションには、DIG Easy Hybの使用はお勧め出来ません。バックグラウンドが高くなる場合があります。
 
     
 
Question AP標識抗DIG抗体Fabフラグメントの抗体の由来は何ですか?
Answer ドイツ産のヒツジです。
 
     
 
Question NBT/BCIPは液体、粉末、ミックスの内どれが一番良いですか?
Answer 価格、保存方法などが異なりますので、ご使用条件に合わせてご選択下さい。
ご自分で調整された発色液で沈殿物やバックグラウンドが問題になる場合は、ready-to-useをお試しください。
出荷時の残使用期限などは、ロットごとに異なりますので、弊社製品学術部もしくは受注センターまでお問い合わせ下さい。
 
     
 
Question Wash & Block Buffer Setの洗浄バッファーはin situ Hybridizationに使用出来ますか?
Answer 一般的なアプリケーションでご使用頂けます。
洗浄バッファーを含め、その他のバッファー類もターゲット組織に依存して検討して下さい。
ターゲットとしている組織での、in situ Hybridization実験が発表されていて、それがうまく行っているなら、そのバッファーを使用されることをお勧め致します。
 
     
 
Question 発色が強すぎる場合はどのようにすれば良いですか?
Answer 一般的には、プローブの濃度を下げるか、ハイブリダイゼーションの温度や洗浄の条件を変えプローブの結合を弱めることにより解決できます。
発色反応は、反応時間を長くし過ぎると、シグナルとノイズの区別がつき難くなります。
発色時間はアプリケーションによって様々ですので、基質を反応させた後は、時々確認する必要があります。
また、基質を加えた後に、低温(冷蔵庫など)で発色反応させることで、ゆっくりとした反応になりますので、最適なS/Nを見極め易いかもしれません。
 
     
 
Question シグナルがぼやける場合はどのようにすれば良いですか?
Answer シグナルの周囲がぼやけて、クリアーなシグナルが検出できない場合があります。
cRNAプローブを使用した場合、ハイブリダイゼーション後にRNase処理を行うことで、シグナルのコントラストが良くなる場合があります。
また、発色反応終了後に、100%エタノールで処理することで、発色の薄い周辺部分から脱色され、比較的クリアなシグナルが見られる場合があります。
ただし、反応時間が長過ぎますと、シグナル自体が脱色されてしまいますので、注意して下さい。
 
   
     
 
その他
 
 
Question in situ HybridizationにDIGを用いる利点は何ですか?
Answer DIGシステムは高感度で、検出に時間のかからないことから、ISHでDIGを使用する研究者が増えています。
RIでの検出には数日を要しますが、DIGを用いた発色検出は数十分あるいは数時間で検出できます。
また、発色検出法を用いることで、組織の概形と、核酸の検出が同時に行えます。
 
     
 
Question DIGでホールマウントin situ Hybridizationは出来ますか?
Answer 可能です。
バイオケミカニュースに1例の記載がありますので、ご参照下さい。
DIGラベルcRNAプローブを用いた、マウス胚におけるcardiac actin遺伝子の検出〜ホールマウントin situ ハイブリダイゼーションの実際〜
バイオケミカニュースNo.91
http://www.roche-biochem.jp/biochemica/bionews_files/no_91/r_91_5.html
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridizationに3例の記載がありますので、ご参照下さい。
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization英語版
・Drospphila胚中のmRNA検出を目的としたホールマウントin situハイブリダイゼーション
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/pdf/ISH_208-215.pdf
・PCRによりDIGラベルされたDNAプローブを用いたDrosophila胚におけるeven-skipped転写物の検出
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/pdf/ISH_216-219.pdf
・Arabidopsis thalianaの間期核における反復配列DNAシークエンスのホールマウント蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/pdf/ISH_220-228.pdf
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization
http://www.roche-biochem.jp/products/pdf/dig/situ/54.pdf
 
     
 
Question DIGを使用したアプリケーションの文献ありますか?
Answer 弊社では、文献そのものの保管を致しておりません。
文献リストとして、下記URLにリストを掲載しておりますので、ご利用下さい。
http://www.roche-applied-science.com/DIG/literature.htm
また、「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」の巻末にも文献リストを掲載しております。
 
     
 
Question パラフィン包埋組織から核酸抽出できますか?
Answer パラフィン包埋組織中に核酸が存在すれば、核酸抽出は可能です。
キシレンを用いた脱パラフィン処理と、エタノール濃度勾配バッファーによる親水処理の後、通常の組織と同様のプロトコールで、核酸を回収することが可能です。
回収核酸量は、組織中の核酸量や核酸の保存状態により変動します。
パラフィン包埋組織からDNAを抽出精製する場合
製品名:High Pure PCR Template Preparation Kit
製品番号:1796828
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1796828a.pdf
パラフィン包埋組織からRNAを抽出精製する場合
製品名:High Pure RNA Paraffin Kit
製品番号:3270289
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/3270289a.pdf
 
     
 
Question コントロール反応用のスライドはありますか?
Answer 弊社では取り扱いございません。
商用として流通しているようです。
 
     
 
Question ポジティブコントロール用のプローブはありますか?
Answer 弊社では、1種類取り扱いがございます。
アプリケーションに応じて、ご自身で設計頂くか、他の流通商品からご選択下さい。
製品名:Actin RNA probe, digoxigenin-labeled(ヒト-アンチセンスβアクチンRNA)
製品番号:1498045
濃度:10μg/ml
鎖長:588bases
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1498045a.pdf
 
     
 
Question AP用の検出用バッファーの組成は何ですか?
Answer 組成は以下のとおりです。
100mM Tris-HCl、100mM NaCl;pH 9.5(20℃)
注意:PODを用いた発色の場合は、特別な検出用バッファーは必要としません。
 
     
 
Question マレイン酸バッファーの組成は何ですか?
Answer 組成は以下のとおりです。
100mM マレイン酸、150mM NaCl;pH 7.5(20℃)
 
     
 
Question ブロッキングバッファーの組成は何ですか?
Answer アプリケーションにより、様々なブロッキングバッファーが紹介されています。
アプリケーションに応じて、各種ブロッキングバッファーを検討する必要があります。
弊社では、カゼインを主成分としたブロッキングバッファーを販売しております。
製品名:ブロッキング試薬(粉体)
製品番号:1096176
英語製品説明書:
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1096176a.pdf
製品名:BSA
製品番号:711454
製品説明書はありません。
 
     
 
Question 抗体反応後の洗浄用バッファーの組成は何ですか?
Answer 組成は以下のとおりです。
100mM マレイン酸、150mM NaCl;pH 7.5(20℃) ;0.3 %(v/v) Tween 20
 
     
 
Question TEバッファーの組成は何ですか?
Answer 組成は以下のとおりです。
10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA;pH 8.0(20℃)
 
     
 
Question 魚精子DNA(Fish Sperm DNA)の由来は何ですか?
Answer 弊社の製品は全てニシン由来です。
製品名:Fish Sperm DNA
製品番号:223646
製品説明書はございません。
製品名:Fish Sperm DNA, MB-grade
製品番号:1467140
英語製品説明書
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1467140a.pdf
 
     
 
Question in situ Hybridizatioを始めるには、何を揃えればいいですか?
Answer 実験系は様々ですので、一概にこれだけ揃えれば大丈夫とは言えません。
「DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization」、および他のプロトコールを参考に、実験系を設計して下さい。
目安としては、組織の免疫染色を日常的に行っている研究室では、加えて一般的な分子生物学の設備が必要です。
分子生物学の研究室では、一般的な組織染色の器具が必要です。
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 英語版
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/InSi_toc.htm
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 日本語版
http://www.roche-biochem.jp/products/detail/detail_dig_m02.html
 
     
 
Question 最適条件を得るには何を検討すればいいですか?
Answer 全てのプロトコール、器具、試薬が結果に影響を与えます。
コントロール実験などを繰り返し、最適条件を調整する必要があります。
実験条件のスタンダードとして、弊社の「DIGアプリケーションマニュアルfo in situ Hybridization」でご紹介しているプロトコールや、類似論文を参考にされてみてはいかがでしょうか。
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 英語版
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/InSi_toc.htm
DIGアプリケーションマニュアルfor in situ Hybridization 日本語版
http://www.roche-biochem.jp/products/detail/detail_dig_m02.html
 
     
 
Question RI標識とハプテン標識では、どちらの方が感度がいいですか?
Answer in situ Hybridizationでの、RIとDIGの感度比較データはございません。
サザンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションでの比較では、ほぼ同等の結果が得られています。
データは「DIGアプリケーションマニュアル for Filter Hybridization」の72ページ「2.3.4 DIGラベルされたRNAプローブを用いた代表的な実験結果」をご覧下さい。
DIGアプリケーションマニュアル for Filter Hybridization 72ページ 英語版
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/DIG_MAN/dig72-83.pdf
 
     
 
Question 検出後のサンプルの保存はどれくらいまで大丈夫ですか?
Answer 検出サンプルは、基本的に写真やデジタル画像として保存して頂くことになります。
検出色素や蛍光色素の褪色、核酸の分解などの可能性があるため、長期保存の過信は危険かと考えます。
 
     
 
Question なぜカエルなんですか?
Answer マニュアル類に登場するカエルはアカメアマガエルです。
かわいらしい容姿と、指先の吸着性のよさから、高感度なDIGラベルのキャラクターとなりました。
DIGアプリケーションマニュアル中に登場するカエルのイラストは、名前を「Diggy(ディギー)」と言います。
 
     
 
Question RNase-Free DEPC処理水はどのように作成しますか?
Answer 蒸留水に対して最終濃度0.1%となるようにDEPC(Diethylpyrocarbonate)を加えて混和し(完全に溶けきらなくても良い)、2〜3時間放置し、120℃で20分間オートクレーブします。
または、RNaseフリー蒸留水は商品としても流通していますので、そちらを検討されてみても良いかもしれません。
 
     
 
Question 金属・ガラス器具のRNase除去はどのように行いますか?
Answer 100%エタノールに対して、最終濃度が10%になるようにDEPC(Diethylpyrocarbonate)を溶かし、この溶液1mlを100mlの蒸留水に加え、室温で2〜3時間放置する。金属器具やガラス器具をこの溶液に浸した後、85℃で60分間乾燥させる。
金属やガラスの器具は、180℃2時間の乾熱滅菌を行うことも可能です。
また、RNase除去処理用の商品も多く流通していますので、そちらを検討されてみても良いかもしれません。
 
     
 
Question 必須なコントロール実験は何ですか?
Answer 最も一般的なネガティブコントロールは、センスプローブです。
充分に長いcRNAを用いたDIG標識プローブでは、これが最低条件のコントロールになります。
手技がうまく行っているかのポジティブコントロールには、β-actinプローブが便利です。
ただし、β-actinの発現量は通常検出する核酸より、一般的に極めて多いことをご承知おきください。
実験系の良悪の判定にはなりますが、必ずしも目的としている核酸の検出を保証するものではありません。
 
     
 
Question in situ Hybridization実験で得られた結果を追試するため、RT-PCRやノーザンなどを行う予定です。追試実験を行う上で注意すべき点、また得られた全てのデータからその解釈を行う上で注意すべき点を教えて下さい。
Answer 逆に、RT-PCRやノーザンの結果をin situ Hybridizationで確認するのが一般的だと思います。
目的のmRNAを発現する細胞が組織の分布が限られているときには、in situ Hybridizationは産生細胞を同定するための非常に有効な方法です。
ノーザンで検出できる程度であれば、おそらくin situ Hybridizationでも発現細胞を検出できます。
RT-PCR法の時、30サイクル程度でやっと検出できるようなメッセージの時は、発現している細胞が組織全体に比べ非常に少数である場合を除けば、in situ Hybridizationでの検出はかなり困難です。
 
     
 
Question in situ Hybridizationと免疫染色の結果が違うことがありますか?
Answer 違うことがあります。
mRNAレベルでの発現はタンパクレベルでの発現とが異なるからです。mRNAレベルの変化の方が早く急峻であるのが一般的です。
タンパクレベルでは、分解などの代謝の速度も影響します。
また、分泌されるタンパクでは、in situ Hybridizationの結果が産生細胞の同定になります。免疫染色では、分泌後に他の細胞内に取り込まれたものも陽性になるからです。