SeqCap EZ 技術概要

SeqCap EZ Library （シークキャップ イージー ライブラリ）は、標的とする領域（ターゲット領域）を選択的に抽出し、濃縮するための試薬で、特異的にターゲット領域と結合するように設計されたビオチン化DNAプローブの混合溶液です。従来のアレイベースのシークエンスキャプチャー手法と比べ、標的領域を抽出する工程で専用機器は必要なく、１本のチューブ内で必要な反応工程が完結されるので、作業の効率化が図れ、多数のサンプル処理にも適しています。また１サンプルあたりにかかるコストも約半分に抑えることができます。

カタログ製品であるヒトエクソームキャプチャー用試薬の他に、研究対象のゲノム領域のみを指定してキャプチャーするためのカスタム製品もご提供しております。

► SeqCap EZ Library の特徴
► シークエンスキャプチャー ワークフロー
► 製品ラインナップ
   ・SeqCap EZ Human Exome Library v3.0
   ・SeqCap EZ Human Exome Library v2.0
   ・SeqCap EZ Choice Library
   ・SeqCap EZ Choice XL Library
   ・SeqCap EZ Developer Library
   ・SeqCap EZ Choice Library - Human 75 Cancer Genes
   ・SeqCap EZ Choice Library - Human MHC
   ・SeqCap EZ Developer Library - Mouse Exome
► 受託サービスについて
► 文献紹介
► ユーザーズガイド等
► オートメーションシステムによるサンプル調製とキャプチャー
► マルチプレックスキャプチャーとは

 

■　SeqCap EZ Library の特徴

• 圧倒的大多数のプローブでターゲットをカバー:  
  210万種類の長鎖プローブを使用することでターゲットに対して深く重なり合うようにプローブを設計。キャプチャーエラーによるシークエンシングの取りこぼしを防止！
• カスタム製品に指定できるターゲットのサイズが広い:  
  カタログ製品（ヒトエクソーム）にカスタム領域を追加したり、ヒト以外の生物種のエクソームキャプチャーをしたり！
• 小規模シークエンスでも良好なカバレージ:
  均一なシークエンスリードが得られるように独自のアルゴリズムでプローブを設計。シークエンス量を節約しても良好なシークエンス結果を取得！
• 多検体処理も可能な簡単プロトコール:
  安定なDNAオリゴプローブを用いたチューブ内での反応！マルチウェルチューブも利用可能！
• ヒトゲノムの解析には品質確認用コントロール領域を予め搭載:
  キャプチャー結果評価に使用するためのプローブ、プライマーの設計不要！

 

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■　シークエンスキャプチャーワークフロー（１）ターゲット領域の選択

ターゲット領域とは、抽出したい（シークエンシングしたい）特定のゲノム領域です。ターゲット領域としては、　特定の遺伝子群のエクソン　、　疾患関連領域などの特定のゲノム領域　、　エクソームや既知のESTなどの網羅的な断片領域　、など、自由に選択していただくことができます。総塩基サイズが各製品の仕様に収まるようにご選択ください。

• ヒト全エクソーム：　44Mb
  　　（カタログ製品）
• マウス全エクソーム：　53Mb　
  　　（準カタログデザイン）
• ヒト75個のがん関連遺伝子のエクソン：　0.5 Mb
  　　（アプリケーションノートより）
• 免疫系関連100遺伝子のエクソン：　0.45 Mb
  　　（" STAT1 Mutations in Autosomal Dominant Chronic Mucocutaneous Candidiasis, N Engl J Med 2011 "　より）
• DFNB79 領域（108遺伝子を含む9q34.3領域）：　2.9Mb
  　　（" Targeted capture and next-generation sequencing identifies C9orf75, encoding taperin, as the mutated gene in nonsyndromic deafness DFNB79., Am J Hum Genet. 2010"　より）

 

▲非連続的な領域（左）、連続的な領域（右）のターゲットシークエンシング例

3段目：ターゲット領域として設定した領域。
2段目：キャプチャー用プローブが設計された領域。
1段目：ターゲットシークエンシング結果（リード/塩基）。 

 

 

■　シークエンスキャプチャーワークフロー（２）プローブの設計（デザイン）

 

プローブの設計はエンリッチメントの成否とシークエンシング結果において最も重要です。
例えば、ターゲット領域に等間隔でプローブを配置するという標準的なタイリングデザインでは、特にエクソン領域をターゲットとした場合では、エクソン間でのカバレージプロファイルにバイアスが生じる傾向があり、良好なシークエンスパフォーマンスが得られない場合があることが実証されています。

シークエンスキャプチャー　および　SeqCap EZ Library では、お客様の指定したターゲット領域に対して、専任のインフォマティシャンが最適なプローブを設計（デザイン）いたします。

 

○　圧倒的大多数のプローブを利用

最大210万種類という圧倒的に大多数のプローブが利用可能であることから、ターゲットに対して複数のプローブを割りあてることができます。プローブ同士は互いに重なり合う位置に配置されますので、例えばミスマッチやインサーションが入ったゲノム断片が、ある1つのプローブでキャプチャーできなかった場合でも近傍のプローブによりキャプチャーされます。このようにプローブを厚く配置することにより、シークエンスデータの取りこぼしを防ぐことが可能なのです。

 

▲シークエンスキャプチャープローブ設計模式図  

 

○　最適化された独自のプローブ設計アルゴリズム

Roche NimbleGenのシークエンスキャプチャーでは長鎖のオリゴヌクレオチドをプローブとして利用しますが、その長さは一定ではありません。リファレンスとなる遺伝子配列に応じて長さを可変させています。さらに、お互いに重なり合うプローブ同士は一定の間隔で配置されているわけではありません。これまでの数多くの実験によって得られた知見に基づく独自のアルゴリズムでプローブが深く重なりあう領域や広く間隔の空いた領域を作ることにより、均一性の高いシークエンシング結果が得られます。

▲シークエンスキャプチャー用プローブ設計模式図

また、SeqCap EZ Human Exome Library v2.0 は、これまでに得られた実験上での知見を踏まえたリバランスアルゴリズムを採用しています。経験的にシークエンシングリードカバレッジの薄い領域や、厚すぎる領域に対してプローブ本数や位置を調整することで、均一なシークエンシング結果が得られ、結果的に小規模のシークエンシングで十分なシークエンスデータを得ることが可能となります。

▲プローブ設計アルゴリズムとシークエンシングリードの関係模式図

 

○　独自のリピートマスク法

ゲノム配列上には高度に反復して出現するリピート領域が分散しています。ハイブリダイゼーション実験用のプローブはこれらのリピート領域を含まないように設計する必要がありますが、一般的なリピートマスク法を適用すると、ゲノム上の約50%がマスクされてしまい、プローブ設計可能領域が極端に狭まってしまいます。Roche NimbleGenのシークエンスキャプチャーでは独自の方法でリピート領域をマスクすることで特異性を保ちながらプローブ設計可能対象範囲を広くとることができます。このため、プローブが設計できないために研究対象のゲノム領域のシークエンスデータプローブが得られない、という事態を避けることができるのです。

▲各リピートマスク法でマスクされた領域（白）と、プローブ設計可能領域（黒）

 

 

■　シークエンスキャプチャーワークフロー（３）デザインの確認・承認

非常に小さい領域をターゲット領域として指定した場合には、ターゲット領域を両外側に拡張することで、目的領域が確実にキャプチャーされるよう工夫しています。また、リピート領域に対してはプローブが設計されませんので、プローブを実際に配置した領域と、最初のターゲット領域の指定領域とは一致しません。このため、Roche NimbleGen で設計させていただいたカスタムデザインは、製品の製造の前に必ずデザイン結果の内容をご確認いただいています。お客様の提示されたターゲット領域と、ご提案したデザインとを比較し、シークエンスデータの必要な箇所にきちんとプローブが設計されているかどうかをご確認ください。提案させていただいたデザインで問題ない場合にもその旨を弊社までご連絡ください。デザインに微調整が必要な場合にはその変更内容をご連絡ください。

▲お客様の指定したターゲット領域と Roche NimbleGen によるデザイン結果のプローブ設計領域模式図

参考資料：　カスタムSeqCapデザイン結果確認ガイド
 

 

 

■　シークエンスキャプチャーワークフロー（４）製品のお届け

シークエンスキャプチャーアレイは常温で、SeqCap EZ Library は冷凍で保存してください。カスタム製品の場合、ご注文（デザイン承認）いただいてからおおよそ 4 週間でのお届けとなります。

 

 

■　シークエンスキャプチャーワークフロー（５）ライブラリの調製

使用予定のシークエンサーで推奨しているライブラリ調製キットのプロトコールに従い、ゲノムDNA から標準的なショットガンシークエンシングライブラリーを作製します。インデックス（バーコード）利用される場合には、インデックス（バーコード）入りのアダプターを使用しするか、インデックス（バーコード）配列を導入してください。

概要）
ゲノムDNAを断片化・ポリッシングします。　（断片サイズは使用予定のシークエンサーに応じて変更してください）
↓
使用するシークエンサーに応じたアダプターをゲノム断片の両端に結合させます。
↓
少数サイクルのLM-PCR（LM-PCR： Ligation Mediated PCR）により増幅します。

 

ゲノムの断片化は、ランダムな位置で切断される方法（ネブライザ、コバリス等）で行いますので、調製したライブラリDNAプールには同一ゲノム領域に対して長さと位置の異なる複数分子種の断片が含まれているはずです。このため、1つのプローブからキャプチャーされると予測されるゲノム領域は1種類のプローブの両側に広がり、プローブ配列の箇所が最もカバレッジが厚く、端ほど薄くなると予想されます。

▲プローブとライブラリ分子のハイブリダイゼーションイメージ

 

 

■　シークエンスキャプチャーワークフロー（６）ハイブリダイゼーション・キャプチャー

概要）
調製したゲノムライブラリーをSeqCap EZ Libraryと混合し、ハイブリダイゼーションを行います。
↓
SeqCap EZ Libraryはビオチン化DNA オリゴプローブ混合溶液ですので、ストレプトアビジンビーズを添加することで、プローブオリゴとゲノムDNA 断片の複合体を回収します。
↓
ストレプトアビジンビーズで結合しなかった断片を洗浄除去します。
↓
エンリッチされた断片プールを少数サイクルのLM-PCR で増幅します。

ハイブリダイゼーションに用いるライブラリ分子は少数サイクルの LM-PCR で増幅したものを用います。このため、この、両端にアダプター配列を持つ 2 本鎖 DNA をハイブリダイゼーションに用いると、アダプター配列同士でのハイブリダイゼーションが起こり、プローブに特異的ではない分子が回収されてしまう可能性があります。Roche NimbleGen の各プロトコールでは、このような非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐために、HE オリゴ （ Hybridization Enhancing Oligo ) を添加しするよう指示しています。これはアダプター配列をブロックするためのオリゴ DNA ですので、使用するシークエンサーの種類によって HE オリゴ の配列は異なります。

 

 

▲非特異的ハイブリダイゼーションを防止する HE オリゴ 模式図

 

 

■　シークエンスキャプチャーワークフロー（７）エンリッチメントの確認

ハイブリダイゼーション・キャプチャーの前後で、ターゲット領域が濃縮されているかどうかを確認します。

ヒトキャプチャーの場合には、アレイまたはSeqCap EZ Library に予めコントロールプローブが含まれています。エンリッチメントの成否を評価するためのプローブをご自身で設計する必要はありません。ヒト以外の生物種での実験の場合には、プローブ設計箇所からいくつかの領域をピックアップして、qPCR プライマーセットを設計してエンリッチメントQCを行ってください。

概要）
ハイブリダイゼーション前後のサンプルをそれぞれの同量ずつテンプレートとして分取し、リアルタイムPCRを行います。
↓
Ct値（Cp値）の差から、コントロールlociのエンリッチメント倍率を算出します。
↓
十分にエンリッチされているキャプチャー済みサンプルは、emPCR や Cluster PCRなどのシークエンシングプロセスの増幅工程に進めます。

 

 

■　シークエンスキャプチャーワークフロー（８）シークエンシング

 

ライブラリを調製する前に使用するシークエンサーを決定し、各シークエンサーに対応したプロトコールでエンリッチメントの実験を行ってください。

 

近年のシークエンサーのスペックの向上に加え、解析コストを低げたいというニーズから、マルチプレックスキャプチャー法が開発されています。

▲マルチプレックスキャプチャー法 模式図 

• インデックス（バーコード）を利用しない方法：　それぞれのゲノムサンプルから独立してライブラリを調製し、独立してキャプチャー＆シークエンシングを実施します。
   
• ポストキャプチャーマルチプレックス：　バーコードの付加されたアダプターを使用してライブラリを調製し、それぞれ独立してキャプチャーを行い、シークエンシング時にキャプチャー済みサンプルを混合します。
   
• プレキャプチャーマルチプレックス：　バーコードの付加されたアダプターを使用してライブラリを調製し、それぞれのライブラリから一定量ずつを混合してハイブリダイゼーション＆キャプチャーを実施します。得られた混合キャプチャー済みサンプルをシークエンシングに用います。
  NEW Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit を利用する場合もマルチプレックスキャプチャーが利用可能になりました！こちらをご参照ください。

マルチプレックスキャプチャーの詳細、データのページへ

 

■　シークエンスキャプチャーワークフロー（９）マッピング等データ解析 

シークエンシング結果（シークエンシングリード）は、リファレンスゲノム配列に対してマッピングを行います。リファレンスゲノム配列の特定の塩基に対するシークエンスリードの数がカバレッジ ( read depth, 冗長度 ) です。シークエンシング規模を大きくするとカバレッジは大きくなります。

▲カバレッジ模式図

▲マッピング結果例

 

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■　製品ラインナップ

SeqCap EZ Library には、ヒトの全エクソンをキャプチャーすることのできる SeqCap EZ Human Exome Library （シークキャップ イージー ヒューマン エクソーム ライブラリ）と、ご自分の研究対象のゲノム領域をキャプチャーするためのカスタム製品がございます。

SeqCap EZ Human Exome Library には下記の2製品がございます。

• SeqCap EZ Human Exome Library v2.0
• SeqCap EZ Human Exome Library v3.0

v2.0 試薬は 44 Mb の RefSeq エクソームを最少の労力でシークエンシングすることができるように設計され、v3.0 試薬は 64 Mb の網羅的なエクソームをシークエンシングすることができるように設計されています。

一方で、任意のゲノム領域を抽出するには生物種とターゲットサイズに応じてカスタム製品をご選択ください。

• SeqCap EZ Choice Library： (シークキャップ イージー チョイス ライブラリ)
  7Mbまで の ヒト ゲノムのターゲットエンリッチメントに
   
• SeqCap EZ Choice XL Library： (シークキャップ イージー チョイス エックスエル ライブラリ)
  50Mbまで の ヒト ゲノムのターゲットエンリッチメントに
   
• SeqCap EZ Developer Library： (シークキャップ イージー ディベロッパー ライブラリ)
  50Mbまで の ヒト以外の ゲノムのターゲットエンリッチメントに

癌関連の75個の遺伝子のエクソン、 ヒトMHC領域、マウス全エクソンをキャプチャーするデザインは、新規デザインのご依頼なしでご利用いただくことができます。

 

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■　受託サービスについて

SeqCap EZ Library を用いたターゲットエンリッチメントの受託サービスは行っておりません。 

  

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