遺伝子発現解析 技術概要

NimbleGen マイクロアレイでは1枚のアレイで網羅的な遺伝子発現解析に対応でき、すでに250種類以上の生物種に対してアレイが設計されています。また研究対象の生物種がカタログに載っていない場合でも、ゲノム情報や遺伝子配列情報がお手元にあれば、その情報をもとにマイクロアレイの設計が可能です。

► プロトコール概要
► NimbleGen 遺伝子発現解析の特徴
► カタログアレイ　&　カスタムアレイ
► ワークフロー
► 実験データ例
► 文献紹介
► 遺伝子発現解析 受託サービス
► 遺伝子発現解析用 マイクロアレイ販売価格
► ユーザーズガイド等

■　プロトコール概要

1. cDNA 合成：
真核生物または原核生物のRNA から、それぞれ、oligo-dT およびランダムプライマーを介して二本鎖cDNA を合成します。

2. cDNA 標識：
NimbleGen ワンカラーDNA ラベリングキットを使用して二本鎖cDNA をCy3 で標識します。

3. ハイブリダイゼーション：
標識cDNA をNimbleGen 遺伝子発現解析アレイにハイブリダイゼーションします。

4. アレイの洗浄・乾燥：
ハイブリダイゼーション済みのアレイをNimbleGen ウォッシュバッファーキットを使用して洗浄し、NimbleGen マイクロアレイドライヤーを使用して乾燥させます。

5. アレイのスキャニング：
洗浄・乾燥済みのアレイをNimbleGen MS200 マイクロアレイスキャナーを使用して532 nm でスキャンします。

6. データ解析：
NimbleScan ソフトウェアを使用してデータを抽出し、遺伝子発現プロファイルを解析します。

▲図1　遺伝子発現解析実験手順

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■　NimbleGen 遺伝子発現解析の特徴

• マルチプレックスアレイ:
  ハイスループット解析に対応！
• 最新のアレイデザインをご利用可能:
  カタログアレイ、カスタムアレイで最新更新版のデータベース情報を元にしたアレイをご利用ください！
• 1遺伝子に複数のプローブ:
  複数のプローブを利用する事でデータの信頼性が向上！
• ロングオリゴプローブ:  
  特異的で高感度のデータを取得！
• 厳密なアレイ品質:  
  良好なアレイ間再現性を実現！
• タブ区切り形式の結果ファイル:  
  Subio Platform, Nexus Gene Expression, ArrayStar®ソフトウェア他、様々なソフトウェアでの解析に対応！

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■　カスタムアレイ　&　カタログアレイ

遺伝子発現解析では、通常、遺伝子のコード領域内の特異性の高い配列から60merのプローブを設計します。遺伝子のコード領域以外のカスタムアレイでのタイリングアレイを用いた解析も可能です。

▲図2　遺伝子発現解析用アレイプローブ設計模式図

■　NimbleGen 遺伝子発現解析用 カタログアレイ
NimbleGenの遺伝子発現解析では、一つの遺伝子に対して複数のプローブを設計しています。「プローブ数/ターゲット」や「Probe/Target」とは、一つの遺伝子に対して設計しているプローブの数となります。同一のプローブをアレイ上に複数回搭載している場合には「レプリケート」にその回数を記載しています。

※ 遺伝子発現解析用マイクロアレイ　製品番号・価格・デザイン対応表_v120401(PDF)

■　NimbleGen 遺伝子発現解析用 カスタムアレイ
研究対象生物種のゲノム情報とご希望のアレイフォーマットをご連絡ください。

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■　ワークフロー： 　受託サービス　&　アレイ販売

お客様の研究のご予定、ご予算、研究対象に合わせて、受託サービスをご利用いただくことも、マイクロアレイをご購入いただき実験していただくこともどちらも可能です。

■　受託サービス
カタログアレイをご指定いただくか、カスタムアレイの設計をご依頼いただき、total RNAサンプル（または2本鎖cDNAサンプル）を送付いただきますと、遺伝子発現解析データを納品いたします。[アレイデザイン情報、蛍光シグナル値の生データ、ノーマライズ済みデータ]

▲図3-1　遺伝子発現解析受託サービスワークフロー

■　アレイ販売
カタログアレイをご指定いただくか、カスタムアレイの設計をご依頼いただき、ご自身で実験を実施してください。

▲図3-2　遺伝子発現解析用アレイ販売ワークフロー

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■　実験データ例

ヒト脳RNA由来サンプルのテクニカルレプリケートを4x72Kマイクロアレイ2枚に別々にハイブリダイゼーションした結果を比較しています。r2が0.99と非常に再現性良くデータが得られることを示しています。右枠に示したように、Universal Human Reference RNAを用いた場合や1x385Kアレイを使用した場合にも、同様に再現性の良いデータが得られています。

▲図4　アレイ間でのデータ再現性

マイクロアレイにより得られたデータを評価するために、マイクロアレイ上に設計していた60個の遺伝子からプライマーを設計して定量PCRを行いました。これらの遺伝子の他、標準曲線用のα-tubulinと、内部標準としてのβ-actinも同様に実験を行いました。マウス肝臓cDNAと脾臓cDNAを用いてそれぞれのプライマーセットでの反応を4回行い、肝臓と脾臓との遺伝子発現比を算出しました。マイクロアレイによる結果を横軸に、定量PCRによる結果を縦軸にして、複数のプロダクトが増幅された遺伝子等を除いた55遺伝子の発現比データをプロットしています。マイクロアレイで得られるデータは定量PCRで得られる結果と非常に良く相関する事が示されました。（Nuwaysir,et al.Genome Res.12, 1749-1755,(2002）)。

▲図6　マイクロアレイデータと定量PCRによるデータ比較

ヒト脳とユニバーサルRNAでの各遺伝子の遺伝子発現を4x72Kアレイ遺伝子発現解析とTaqManによる定量実験によって測定し、それぞれの実験方法での脳/ユニバーサルRNA比を算出して両実験手法での結果を比較しました。NimbleGen 4x72Kアレイに搭載されている961遺伝子について比較を行っています。図7に示したように、非常に高い相関が確認されました（R=0.92）。右枠に示したように、1x385Kアレイ、12x135Kアレイでも同様に定量PCR実験と良く相関していました。

▲図7　マイクロアレイデータと定量PCRによるデータ比較

▲図8　遺伝子発現変化による遺伝子のスクリーニング   サンプル1と2について、酵母全遺伝子（6,337遺伝子）の遺伝子発現を解析しました。サンプル1、サンプル2の各遺伝子発現強度（log2値）をそれぞれ横軸、縦軸にとり、個々の遺伝子のそれぞれの条件下での遺伝子発現強度をドットで表しています（scatter plot）。t 検定（有意水準：0.05）を行って有意な差が認められなかった5,490遺伝子（図8-2)を除くと、847個の遺伝子がサンプル1とサンプル2の間で変化のある遺伝子としてスクリーニングされました（図8-3)。

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