Non-RI in situ Hyb. FAQs｜ロシュ・アプライド・サイエンス

Non-RI in situ Hyb. FAQs

このFAQsは、DIG（ジゴキシゲニン）などのハプテンや蛍光標識を用いたin situハイブリダイゼーションを対象としたFAQsです。Non-RIでISHを行う際の、ご参考にして頂ければ幸いです。

また、DIGアプリケーションマニュアル in situハイブリダイゼーションとDIGアプリケーションマニュアル for Filter ハイブリダイゼーションもご用意しております。更なる情報をお求めの方はこちらのマニュアルも、ご利用下さい。

このマニュアルは、印刷物としても無償で配布しております。製本版マニュアルは資料請求サイトからご請求下さい。

なお、ここに記載されているFAQの他に、逐次アップデートしているDIG in situハイブリダイゼーションFAQサイトもご用意しておりますので、あわせてご覧ください。

第1章	一般的なin situハイブリダイゼーション(ISH) に関する質問
	NON-RI ISH の感度全般について NON-RI ラベルされたプローブの検出限界についてアルカリホスファターゼ系とペルオキシダーゼ系との比較実験に適したラベリング方法の選択プローブの選択 DIG ラベルされたRNA プローブを用いた組織切片ISH のためのプロトコールハイスループットISH
第2章	蛍光検出によるin situ ハイブリダイゼーション(FISH) に関する質問
	直接ラベリング法(FITC-UTP) と間接ラベリング法（抗DIG-FITC 抗体）染色体スプレッドのためのプロトコールお勧めのFISH 用プローブ：ニックトランスレーション用ミックス(Nick Translation Mixes) HNPP* / Fast Red （アルカリホスファターゼ基質）を用いたFISH 二重または多重染色によるFISH FISH：シグナルが弱い、またはシグナルが得られない染色体サンプル上に蛍光シグナルがみられない蛍光バックグラウンドが高い/ バックグラウンドを減少させるには蛍光シグナルが予想外に複数の部位にみられる組織切片FISH のバックグラウンドが高い核小体形成部位またはパフに非特異結合がみられる染色体サンプル上に不規則な点状バックグラウンドが散在する染色体に隣接して強い蛍光シグナルが拡散する FISH のための染色体サンプルの保存ハイブリダイゼーション後に染色体の形態が劣化する FISH により染色体が失われる蛍光シグナルが減衰する
第3章	プローブプローブの選択ラベリングに関する質問
	プローブを選択する際の一般的な注意点プローブの選択： PCR / RNA / オリゴプローブ分子量の大きなDNA プローブはISH には適さないアルカリ不安定なDIG でラベルされた核酸プローブ極めて少量のmRNA 検出のためのプローブ in vitroトランスクリプション用ベクター RNA プローブの調製 DIG RNA プローブのラベリング効率を求める RNA プローブの最適な長さ RNA プローブのアルカリ加水分解 DIG RNA ラベリングの性能. 重要なヒントアンチセンスプローブ対コントロール用センスプローブ：ノーザンブロットによる比較オリゴプローブのラベリング/ カコジル酸バッファーオリゴに関してお勧めすることオリゴプローブの実験条件オリゴプローブを用いたISH：アセチル化 DIG ラベルされたプローブのOD への影響とプローブの精製特殊なテンプレート（AT.リッチまたはAT が少ない）を使用するには ISH に適したプローブ濃度二重検出(Dual Detection) のための異なるハプテンを用いたダブルラベリング
第4章	組織の固定包埋前処理に関する質問
	組織の基本的な固定方法固定液の違い組織の調製/ 血液塗沫標本の組織固定基本的な包埋と切片作製法メタクリル酸包埋/ 品質の重要性切片作製上の問題点エオジンY 色素：切片作製時の組織の向きを定めるスライドグラスから組織切片が無くなる/ スライドの代用組織切片が無くなる/ プロティナーゼK 処理プロティナーゼK を用いた前処理過度のプロティナーゼK 処理による、非特異的なバックグラウンドが生じることがあるプロティナーゼK 処理により、シグナルが弱まることがあるアセチル化により非特異バックグラウンドが低くなるキシレンやエタノールにはDEPC の添加は不要
第5章	ハイブリダイゼーションとブロッキングに関する質問
	ISH に使用するバッファー全てにDEPC 処理水を使用しますお勧めのハイブリダイゼーションバッファーお勧めのフォルムアミド ISH のためのハイブリダイゼーションバッファーは市販されていません DIG Easy Hyb はISH にはお勧めできないブロッキングに関する一般的な注意点ホールマウントのためのブロッキング試薬 ISH のためにお勧めのtRNA 組織のダメージを防ぐため、きれいなカバーグラスを使用します
第6章	検出カウンター染色封入に関する質問
	NBT/BCIP を用いたISH 検出発色検出の持続性検出バッファー中のMgCl2 発色反応の持続性/ シグナルが周囲の組織中にしみ出る使用期限切れのNBT/BCIP シグナルが青色でなく弱い褐色になる NBT/BCIP の沈殿が暗青色になる NBT/BCIP 検出において青色のバックグラウンドが常に高いカウンター染色 NBT/BCIP のシグナルが退色する
第7章	トラブルシューティング
第8章	リファレンス
第9章	in situ ハイブリダイゼーションに役立つウェブリンクのセレクション

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