FAQ サイト (よくあるご質問とお答え)

ネガティブコントロール（Non-Template Control;NTC）測定で立ち上がりが見られる場合、非特異的な増幅やコンタミネーションが疑われます。
NTCにテンプレートの混入がある場合は、サンプルの定量結果の信頼性が損なわれている可能性がありますのでコンタミネーションの回避・除去を行う必要があります。

まず最初に：
非特異的なシグナルが、コンタミなのか、プライマー由来の産物（ダイマー等）なのかを確認します。
特にSYBR GreenI法の場合、プライマーダイマーの生成もシグナルを検出してしまいますので
まずは、融解曲線分析（Tm解析）とゲル電気泳動(分子量)より判別を行います。

コンタミネーションの除去：
・疑われるプラスチック消耗品(チップ,チューブ等)を新品に交換します。
*プラスチック製品の新品をオートクレーブすることやバルク品の充填は避け、滅菌済製品などを新しいまま使用します。
?オートクレーブの使用状況によって、オートクレーブ由来のコンタミが生じることがあります。

・試薬のバイアルは新しいものを使用します。
*汚染源が定かでは無い場合、変更可能なものは全て変更します。
?部分的に変えていくと相互に汚染を繰り返し、解消が遅れることがあります。

・NTCや試薬調製用の水はPCRグレード製品を使用します。
*自家調製したMilliQ水等では、容器等の汚染が影響を与えることがあるため、市販製品をおすすめします。

・専用のピペットを使用し、チップはフィルタ付きチップを用います。*
*不特定多数の方が使用したり、何に使われたかわからないピペットの使用は避け、汚染防止のフィルタ付きチップの使用をおすすめします。

・試薬の調製場所と、PCR産物の取り扱い場所やサンプル破砕等を行う場所は別室にします。
*エアロゾルや混入リスクを抑えます。

キャリーオーバーコンタミネーション(PCR産物)の除去：
前回以前のPCR産物が混入していると予想される場合、下記の方法が有効なことがあります。

・ウラシル-DNAグリコシラーゼ(UNG)の使用
* PCR反応中にUTPを用いている場合、本酵素を添加することで、PCR測定前にUを含むPCR産物を分解することができます。
?（ライトサイクラー ウラシルDNAグリコシラーゼ (UNG）をご利用ください。）

・同じ遺伝子のプライマーデザインを変更する
*特定の産物の混入であれば、汚染産物に含まれない領域にプライマーを変更することで影響を無視することができる場合があります。

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