制限酵素
Q: 複数の酵素での同時切断：もしくは連続して制限酵素処理することを推奨しますか？
A:
2つの制限酵素でDNAを切断することは一般的な反応で、多くの場合2つの制限酵素は異なるバッファーを必要とします。ダブルダイジェストにはいくつかの推奨する事柄があります。
・同じバッファーで両酵素を反応させます。
多くの場合、たとえ一方の酵素に最適なバッファーでなくても、まだ十分に切断します。ロシュ・アプライド・サイエンスにはdouble digest tableがあります。このリストは個々のダブルダイジェストに最適なバッファーを示しています。この反応がスター活性の影響による規格外の断片を生じた場合、反応時間や酵素量を減らします。この反応が完全でなかった場合、個々の酵素を別々に検証しプラスミド直鎖化能力を決定します。切断の欠落は、酵素の不活性化や認識部位が無い事、テンプレートパラメーターが阻害している事などを示しているかもしれません。コントロールとして別のターゲットで酵素を検証します。両方の酵素が活性を持っており、いくつかの切断部位が含まれる場合、断片末端に近接した切断部位の問題かもしれません。
・1つ目の酵素で切断し、続いてバッファーを変更し、2つ目の酵素で切断します。
最初に、より低塩濃度のバッファーを必要とする酵素で反応させます。続いて、2つ目の酵素に必要なバッファー組成に調節します。
・2つの酵素反応の間にバッファーを交換します。
1つの酵素反応を行い、DNAを回収（エタノール沈殿）し、2つ目の酵素に最適なバッファーにDNAを再懸濁します
・連続して切断します。（バッファー組成を変更する、もしくは変更しない）
制限酵素が異なる反応温度を要求する場合。
・同じバッファーで両酵素を反応させます。
多くの場合、たとえ一方の酵素に最適なバッファーでなくても、まだ十分に切断します。ロシュ・アプライド・サイエンスにはdouble digest tableがあります。このリストは個々のダブルダイジェストに最適なバッファーを示しています。この反応がスター活性の影響による規格外の断片を生じた場合、反応時間や酵素量を減らします。この反応が完全でなかった場合、個々の酵素を別々に検証しプラスミド直鎖化能力を決定します。切断の欠落は、酵素の不活性化や認識部位が無い事、テンプレートパラメーターが阻害している事などを示しているかもしれません。コントロールとして別のターゲットで酵素を検証します。両方の酵素が活性を持っており、いくつかの切断部位が含まれる場合、断片末端に近接した切断部位の問題かもしれません。
・1つ目の酵素で切断し、続いてバッファーを変更し、2つ目の酵素で切断します。
最初に、より低塩濃度のバッファーを必要とする酵素で反応させます。続いて、2つ目の酵素に必要なバッファー組成に調節します。
・2つの酵素反応の間にバッファーを交換します。
1つの酵素反応を行い、DNAを回収（エタノール沈殿）し、2つ目の酵素に最適なバッファーにDNAを再懸濁します
・連続して切断します。（バッファー組成を変更する、もしくは変更しない）
制限酵素が異なる反応温度を要求する場合。
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