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全ての制限酵素とそれに対応するDNA修飾メチルトランスフェラーゼは、それらの遺伝子とタンパク質の構造、コファクターの依存関係、結合と切断の特異性によってクラスIとII、IIIに分類されます。
クラスI酵素は、制限酵素活性とDNA修飾活性を併せ持ちますが、各活性部位は多機能酵素複合体の別のサブユニット上に局在します。Mg²⁺イオンとATP、コファクターとしてS-アデノシルメチオニン（S-adenosylmethyonine：SAM）を必要とします。これらの酵素は、認識配列の100 - 1000 bp下流の非特異部位でDNAを切断します。
クラスII制限酵素は、対応する修飾メチルトランスフェラーゼと別のタンパク質として働きます。このクラスの酵素は部位特異的で、認識配列の内部やその付近で、特異的にDNA両鎖のリン酸ジエステル結合を切断します。コファクターとしてMg²⁺を要求します。
クラスIII制限酵素は、クラスI制限酵素のように、制限酵素活性と修飾活性を一つの酵素の異なるサブユニットに持ちます。これらの酵素は特異的配列を認識しますが、認識配列の外側の3'方向に25 - 27 bpの部分を切断します。Mg²⁺イオンを必要としますが、クラスIのようにATPaseは持たずSAMは全く必要としません。
クラスIIエンドヌクレアーゼは、完全な配列特異性を示しますので、分子生物学実験や組み換えDNA実験、マッピング、制限酵素断片長多型（RFLP）、シークエンス、クローニングで一般的に用いられます。この点において、クラスIIが主な制限酵素と考えられます。