カテゴリ名: プローブ作成について
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- 組織切片中から非常に発現量の少ないmRNA を検出しようと考えています。どのようなISH 検出系がお勧めですか？ 最も感度が高いと考えられるISH 系を教えてください。
(1416 回の閲覧) - PCRによりDIGラベルされたDNAプローブをin situ実験に使用したいと考えています。このプローブの長さは１kb ですが、DNA プローブが加水分解される可能性はありますか？ DIG アプリケーションマニュアルfor in situ ハイブリダイゼーション（56ページ）に記載されるアルカリ加水分解（http://www.roche-biochem.jp/products/pdf/dig/situ/4.pdf）により、RNA プローブのDIG-NTP結合が切断されることがありますか？ また、アルカリ不安定性DIG-dUTP に使用可能なその他の加水分解の方法について教えてください。
(1840 回の閲覧) - 10 kb の長さのDIG ラベルされたDNA プローブをin situ ハイブリダイゼーションに使用することはできますか？
(1880 回の閲覧) - 最近、PCR DIG Probe Synthesis Kit を使用してin situ ハイブリダイゼーション用の210 bp の長さのDIG プローブを調製しました。１：３の比率でラベルされたヌクレオチドをハイブリダイゼーションバッファー中に１：20希釈し、42℃にてオーバーナイトでインキュベーションを行った場合にのみこのテクニックは有効でしたが、反応は弱いものでした。これとは別に、インターナルのオリゴプローブ（オリジナルの210の内の50ヌクレオチドを含む）の５? 末端をDIG ラベルしましたが、このプローブはISH には全く働きませんでした。この状況を改善するために最適なDIG ラベリング法について教えてください。
(1090 回の閲覧) - 転写反応中のジゴキシゲニン?11?UTP の濃度を変えると、特定のプローブではラベリング効率が高まることがあると聞きました。これを私たちが合成するプローブに適用してみたいと思いますが、DIG RNA Labeling Mix に含まれる10× NTP ミックスではDIG-UTP の濃度が既定されています。DIG-UTP 濃度を変えるのにお勧め方法があれば教えてください。
(1179 回の閲覧) - ロシュ・アプライド・サイエンスのDIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) を使用してin situ ハイブリダイゼーションのためのRNA プローブを合成しています。得られたプローブの量をOD260にて測定しようと試みましたが、明瞭な結果が得られませんでした。例えば、260/280 nm の値が低くなります。DIG はこの測定の妨げになるでしょうか？
(1676 回の閲覧) - アセチル化のステップは必要ですか？
(1701 回の閲覧) - 現在DIG 3’ End Labeling Kit を用いて何種類かのオリゴプローブ(26 mers) をラベルし、DIGNucleic Acid Detection Kit を用いてISH のシグナルを検出しています。
現在問題となっているのは、嗅覚組織中でセンスオリゴプローブ（６種類の異なるmRNA ターゲットに対する６種類のオリゴ）が、アンチセンスオリゴプローブとよく似たタイプの細胞を認識するため、センスオリゴプローブによるin situ ハイブリダイゼーションが特異的のように見えてしまうことです。別途にノンセンスオリゴをネガティブコントロールとして使用した実験においても、反応の結果はセンスプローブを使用したコントロール反応と同様でした。これらの実験において、ストリンジェンシーの最適化によりアンチセンス反応とセンスコントロール反応とをうまく識別することはできないことが分かりました。ハイブリダイゼーション溶液には２％ SDS を使用し、tRNA は含まれません。
(1696 回の閲覧) - in situ ハイブリダイゼーションによりmRNA の局在を検出するためのプローブを合成するために、DIG Oligonucleotide Tailing Kit を試しています。使用上のヒントやアドバイスがあれば教えてください。
(1532 回の閲覧) - in situ ハイブリダイゼーションのためのプローブをラベルしようと思います。貴社のプロトコールによるとカコジル酸カリウムバッファーが使用されています。この試薬を手に入れる方法について教えてください。
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