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ジーン エクスプレッション コーナー |
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-GenoPureキット- トランジェントなトランスフェクションに使用するDNAプラスミドの迅速で簡便な精製キット |
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| 特長 ■500μgまでのプラスミドDNAの分離 ■フィルターの使用により遠心操作がいりません ■高コピー数のプラスミドのバクテリア培養液30-150 mlから10回分離 はじめに SDSと組み合わせたアルカリ溶解法は、15 kb以下のプラスミドDNAの調製法として一般的なものです。真核細胞へのトランスフェクションなどの厳しいアプリケーションにDNAを使用する際には、RNAやタンパク質、炭水化物などを除去する必要があります。ここ十年来、クロマトグラフィーを使用した市販キットが、時間のかかる塩化セシウム密度遠心勾配法に代わり使用されてきました。新しいシステムを評価する際に、標準法として比較測定されるのは、プラスミドDNAを結合および溶出させるためのジメチルアミノエチル（DEAE）陰イオン交換シリカビーズを採用したキットです。われわれは、頻繁にこれらのキットを使用していますが、今回、ジェノピュア プラスミド マキシキットと比較しました。 |
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われわれの結果は、ジェノピュアキットがほとんどの分子的アプリケーションに最適な高純度のプラスミドDNAを迅速かつ簡便に得られることを示しました。 材料と方法 DNAの調製 2種類の高コピー数のプラスミドであるpBCL-2とpRP16を実験に使用しました。プラスミドpBCL-2はpBL3ベクターにヒトbcl-2プロモーターをクローニングし、pRP16はラットp16プロモーターをpGL2にクローニングしてあります。両方のプロモーターはホタルルシフェラーゼの発現をもたらします。トランスフォームされたDH5α E. coli を200 mlのLB培地中で一晩増殖し、DNA分離の前に等量に分注しました。プラスミドはそれぞれの使用説明書どおりに調製しました。制限酵素消化の後、DNAを1.5%アガロース/0.2×トリス酢酸-EDTA（TAE）ゲルで分析しました。 トランスフェクション ヒトの肺上皮細胞株A549とCalu-3をプラスミドpBCL-2でのトランスフェクションに使用し、ラットの腫瘍細胞R623と1149をpRP16でのトランスフェクションに使用しました。24ウェルに播種された細胞はトランスフェクションの日には20%のコンフルエントでした。すべてのトランスフェクションはFuGENE 6で行いました。プラスミド（0.2μgのpBCL-2あるいは0.4μgのpRP16）は、0.1μgのウミシイタケのルシフェラーゼ発現ベクターpPL-TKとコトランスフェクションされました。ウミシイタケのルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ発現の較正用の内部コントロールとして使用されます。使用説明書に従い、FuGENE 6とDNAの比率は2：1（μl：μg）として、すべての実験に使用しました。トランスフェクションは1個の細胞につき2回行い、再度繰り返しました。トランスフェクションの48時間後に細胞を溶解し、発現はデュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）で分析しました。 結果と討論 われわれは2種類のキットで効率を比較しました。ほぼ同量のDNAが分離され（表1）、プラスミドの純度もアガロースゲル電気泳動（図1a）と制限酵素消化（図1b）でチェックしました。 |
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Genopureキットでは、より多くの収量と高い純度のDNAが調製されました。結果として、プラスミドDNAは一般的な細胞やトランスフェクションが困難な細胞でのトランスフェクションに成功し、最も厳しいアプリケーションに直接使用できました。 トランスフェクションの結果は、レポータージーンであるホタルルシフェラーゼの発現で示されました（表2）。Genopureによるトランスフェクション効率は、コトランスフェクションされたコントロールのウミシイタケのルシフェラーゼに関しても概して良好（高くない場合でも）でした（図2）。 |
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| われわれの比較データはGenoPureプラスミド マキシキットにより、従来法よりも高純度なプラスミドDNAが得られることを示しました。第1に、中和バクテリア溶解液を清澄化する単純なろ過ステップは、フィルターカートリッジ（あるいは遠心）を取り扱うよりも簡便です。第2に、Genopureキットでは、クロマトグラフィー法では必要な洗浄や溶出ステップが少ないため、30%の時間短縮となります。結論として、このキットは最も厳しい分子生物学のアプリケーションに適する、高純度プラスミドの分離における優れた代替品ということができます。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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BIOCHEMICA2004NUMBER4(No97) |
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