新発売のライトサイクラー-CK20定量キットは，オンコロジー研究分野のパラメーター特異的試薬を拡張しました。このキットは10⁶個の末梢血細胞から，わずか1個のCK20陽性細胞の定量的検出を可能とします。

背景
　転移期が無いにもかかわらず起こる多くの腫瘍の再発は，従来の方法では正確に検出できない，微少転移によると信じられています。その増大した感度のため，PCRをベースにした方法は，微少転移の検出を可能とするツールとしての研究がなされています。この目的のために多くのマーカーが，制限された発現パターンを持つ第一の候補者としての，その適合性を評価されてきました。異質の環境でのそれら遺伝子の発現は，腫瘍細胞の浸出の潜在的な指標と考えられます。ヒトサイトケラチン20（CK20）は，細胞内骨格に関与している，中間フィラメントファミリーの上皮サブグループに属しています。すべての他のサイトケラチンと同様に，その発現は組織のタイプにより変動しています。その制限された発現により，CK20は第一に結腸直腸ガンや尿路上皮ガンにおいて，微少転移のマーカーの第一候補として研究されてきました。CK20の検出は，再発リスクの増大や腫瘍のステージに相関しています。

製品の記述
　ライトサイクラー-CK20定量キットは，ライトサイクラー機器を使用してのキャピラリーガラス内でのPCR用に，特別に調整されています。サイトケラチン20(CK20) RNAの検出は，2ステップの操作法で行われます。最初のステップで，AMVリバーストランスクリプターゼとランダムヘキサマーのプライマーにより，RNAからcDNAが逆転写されます。第2のステップで，特異的なプライマーを使用してのPCRで，cDNAからCK-20エンコードmRNAの124 bpフラグメントが増幅されます。アンプリコンは，特異的なハイブリダイゼーションプローブ対により，蛍光検出されます。同じDNA調製品を別のPCR反応で使用して，ポルフォビリノーゲン デアミナーゼ（PBGD）をエンコードしたmRNAがリファレンスの遺伝子として生成されます。反応産物はRNAの完全度のコントロール，および相対的定量のリファレンスとして役立ちます。CK20 mRNA量を測定するために，ライトサイクラーの新しい相対的定量ソフトウェアが応用されます。キット性能の詳細は，下記の“ライトサイクラーでのサイトケラチン20の相対的定量”の記事をご覧ください。

−研究サンプルでの微少転移の検出へ洞察をもたらす革新−

はじめに
　従来の方法では検出不可能な残余の腫瘍細胞は，表面的な腫瘍切除後のガン再発の原因であるとされています。組織および腫瘍特異的遺伝子のRT-PCR増幅による，血液や骨髄，リンパ節などの腫瘍外サンプル中の，“微少転移”あるいは“最少残余疾患”と呼ばれるものの検出の可能性は，最近における研究の増加を駆り立てています。微少転移のマーカーの有望な第一候補は，サイトケラチン20（CK20）です。発現研究は，その発現が胃腸組織，胸部移行性およびMerkel細胞ガンに制限されることを見出しました。それゆえ，腫瘍外サンプル内のCK20の検出はこれらの，腫瘍からの転移を指標するでしょう。しかし，いくつかの研究はCK20のRT-PCR検出とステージ，程度，再発の間の関連を見つけましたが，他の研究は，差異の無さや非特異的検出を報告しました。

逆転写
　cDNAは10μlのRNA，1μlのライトサイクラー-CK20 リバーストランスクリプターゼ，4μlの反応ミックス，2μlのdNTPs，1μlのランダムヘキサマーを含む20μlの反応液中で作成された。反応液は25℃で10分間，42℃で30分間，94℃で5分間インキュベートされた。

ライトサイクラー PCR
　ライトサイクラーでのPCR増幅と検出は，DNAハイブリダイゼーションプローブフォーマットで行った。各反応液20μlは，2μlのcDNA，2μlのCK-20酵素マスターミックス，2μlの検出ミックス（プライマーとハイブリダイゼーションプローブを含む）あるいはCK-20リファレンス検出ミックス（プライマーとハイブリダイゼーションプローブを含む）を含む。各サンプル毎に2つの反応，1つはCK-20で1つはリファレンス遺伝子PBGDを，別のキャピラリーで行った。ライトサイクラー機器内で最初に94℃で1分インキュベートした後，94℃で0秒，60℃で10秒，72℃で5秒を50サイクル実行した。PCRのランは40で30秒のインキュベーションで終了した。蛍光は，各60℃のインキュベーションの最後にモニターされた。チャンネルF2/F1で検出された蛍光は，ライトサイクラーの分析ソフトウェアを使用して解析された。各反応の交点が，セカンドデリバティブ・マキシマムアルゴリズムと算術的ベースライン調節を用いて，測定された。

PCR定量
　CK20を定量するために，キャリブレーターサンプルのCK20とPBGDの比に相対する，未知サンプル中のCK20とPBGDの比を，ライトサイクラー相対定量ソフトウェアを用いて測定した。キャリブレーターは各ランに含まれ，1,000,000の値にセットされた−それゆえ10,000の比であるサンプルは，キャリブレーターよりCK20が100倍少ない。相対的なCK20の比を測定することはPCR反応の効率を見て，未知とキャリブレーターサンプルのCK20とPBGDの交点を決定する機能を持つ。

結果と討論
　以前の微少転移マーカーの検出アッセイは，ネステッドRT-PCRとそれに続くアガロースゲル上での可視化より成り，定量的に限界のある解析法でした。ロシュ・ダイアグノスティックスはライトサイクラー-CK20定量キットを開発し，微少転移の検出に顕著な優位性を提供しました。

ラージスケールの解析処理が可能
　反応濃度の至適化と反応ミックスの提供により必要な操作手順が最小限になり，ライトサイクラーのクローズシステムであるキャピラリーと共に，クロスコンタミネーションの危険性を減らします。迅速なキャピラリー熱サイクリングを使用することで，45分のPCRを含みすべてのアッセイが2時間で完了しますので，多検体の解析処理が可能となります。

最も高い特異性
　CK20とPBGDにおいて，PCR検出は4個の配列特異的オリゴヌクレオチドがアニーリングした時のみに行われます。これらのプライマーとハイブリダイゼーションプローブは，ゲノムDNA検出の可能性を除外するために，エクソン-イントロンの境界に渡るようにデザインされています。

交点でのPCR産物の定量
　このアッセイの主要な特徴は，ライトサイクラーを使用してPCR量のモニタリングと定量が出来ることです。ハイブリダイゼーションフォーマットの使用により，すべてのPCR反応過程が蛍光検出によりモニターされ，定量の最も信頼できる時点と考えられている，検出可能な指数期の開始点（“交点”）での測定を可能にします。

検出限界の改善
　“ホットスタート”PCR酵素（ファストスタートTaq DNAポリメラーゼ）の使用により，プライマー・ダイマーの形成が減少され，微少転移の検出に関連する低コピー数において重要な利点である，最大の感度が保証されます。感度試験は従来のアッセイの検出限界を改善していることを示しています。スパイク実験では，1 mlの血液や10⁵個のHL60前骨髄性白血病細胞のバックグランドにおいて，1個のHT29結腸直腸細胞からのCK20を検出することが出来ました。スパイクしないバックグランド細胞はネガティブでした（データ不掲載）。プラスミド希釈実験では，1コピーのCK20とPBGDが検出できました（図1）。

標準化された定量
　アッセイの開発に加え，使用される定量モデルもまた重要な検討点でした。交点はサンプル量の指標を提供しますが，それらの標準化と比較化できる値の解釈に適したモデルは，いまだ確立されていません。効率により調整された相対的定量モデルが，新しいライトサイクラー 相対定量ソフトウェアに備えられました。これは定量に潜在的に影響する因子をコントロールする3種類の要素を含むため，再現性が最大となります。

まとめ
　この研究は，研究応用における微少転移の検出に価値のあるツールとなる，新しいライトサイクラー-CK20定量キットについて記述しています。このアッセイは，定量的で，迅速・簡便，柔軟，特異的，高感度であり，多検体のルーチン解析にも使用可能です。PCR定量モデルが再現性を最大にするために使用され，研究室間の標準化のプラットフォームを提供します。このアッセイはより情報が得られる解析法で，微少転移検出の研究間に存在する不一致の背後にある理由を解明する助けとなります。このような標準化されたラージスケール解析を可能とする定量アッセイは，バックグランド発現の閾値を決定と腫瘍測定の潜在的な重要性を評価する可能性に道を開き，更なる研究でこの可能性を明瞭にする必要が有ります。

−オンコロジー研究：これより簡単で正確なHER2/neu DNA定量はありません。

はじめに
　ヒト上皮成長因子レセプター-2（HER2，またHER2/neu，c-erbB2とも）遺伝子は，染色体17q21にマップされるプロトオンコジーンです。これは185 kDの膜貫通形の糖タンパク質で，HER2/neuタンパク質あるいはレセプターと呼ばれています。HER2/neuはチロシンキナーゼファミリーのメンバーで，ヒト上皮成長因子レセプター(EGF-R)と高い相同性があります。HER2/neuの増幅あるいは/および過剰発現は，ヒトガンの広い範囲（胸部，卵巣，子宮内膜，子宮頚部，肺，胃，結腸，間葉，食道，膀胱，腎臓，頭部および頚部の偏平細胞，膵臓，唾液腺，胸腺のガン）でしばしば観察されます。

製品の記述
　ライトサイクラー-HER2/neu DNA定量キットは，ライトサイクラー機器を使用してのキャピラリーガラス内でのPCR用に，特別に調整されています。HER2/neu遺伝子の112 bp断片と，ヒトゲノムDNAからのリファレンス遺伝子の133 bp断片が増幅されます。それと同時に，ハイブリダイゼーションプローブの2種類の特異的ペアにより，検出されます。

はじめに
　純粋で完全なmRNAを大量に分離することは，組織特異的遺伝子発現のモニタリングにおいて大変重要で根本的な鍵となります。MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）は，MagNA Pure LC機器上での，1-10 mgの凍結組織からのmRNAの精製用にデザインされています。キットは192回のmRNA分離に必要なすべてのバッファー（表1）を含み，追加試薬は必要としません。このmRNAの分離法は磁性体粒子技術に基づいており，精製の初期ステップで試薬がヌクレアーゼを阻害しています。全自動プロセッシングとこれらの特徴の組み合わせにより，遺伝子発現分析などのすべてのダウンストリーム応用に要求される，高い収量と品質のDNAフリーのmRNAを得ることが出来ます。

材料と方法

MagNA Pure LCでの凍結マウス組織からのmRNA分離

→プレ分離ステップ
　1-10 mgの凍結（−80℃）マウス肝臓のホモジナイズを溶解バッファーとホモジェナイザー（Ribolyser[Hybaid]，Ultra Turrax[IKA]あるいは乳鉢/乳棒/ニードル）を使用して行う。ビオチン標識Oligo(dT)を含むキャプチャーバッファーを加える。放出されたpoly(A+)テイルmRNAはOligo(dT)に特異的にハイブリダイズする。遠心後，ライセートの上澄みを回収し，MagNA Pure LCサンプルカートリッジの中へ移す。

ライトサイクラーでのRT-PCRとコントロールPCR分析
　核酸の分離後，MagNA Pure LC機器でRT-PCRとコントロールPCRをセットアップし，ライトサイクラーによるハイブリダイゼーションプローブフォーマットで，5μlの分離mRNA溶液と20μlの最終反応液量で，RT-PCRとコントロールPCRを行った。

ノーザンブロット分析
　分離したmRNAをノーザンブロット分析に用いた。100μlの溶出mRNAからの7.5μlを，変性ゲル電気泳動で分離した後，ナイロンメンブレンにトランスファーし，β-アクチン転写DIG標識プローブと68℃でオーバーナイト，ハイブリダイズした。結果は，ルミ-イメージャーF1ワークステーションでモニターした。

ノーザンブロット分析
　MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）で単離したmRNAの重合度が，β-アクチン転写DIG標識プローブを使用したノーザンブロット分析で確認された。mRNAは，10 mgの様々なタイプの組織（マウス肝臓，脾臓，腎臓）から3種類のホモジェナイズ法（Ribolyser，Ultra Turrax，乳鉢/乳棒）で分離された。図のハイブリダイゼーションパターンは，各サンプルにおいて期待されるサイズ（1.8 kb）の明瞭なバンドを示した（図2）。ホモジェナイズ法としてRibolyserを使用して分離したmRNAサンプルは，他の方法より強いバンドを示した。これらの結果は，Ribolyserによるホモジナイズが，最も高いmRNA収量を得られることを示唆している。

スケールアップ実験
　開始材料のスケールによる再現性におけるMagNA Pure LCの性能が，Ribolyserホモジェナイズ法を使用して，様々な量のマウス組織（脾臓と肝臓）からのmRNAの分離でチェックされた。分離されたmRNAは，ライトサイクラー機器での1ステップRT-PCRによる，サイクロフィリンA転写産物の増幅に使用された。RT-PCRの結果を図3と4に示す。両方の組織タイプで，RT-PCRのグラフは通常の推移を示し，交点の分析はそれぞれ相関係数0.97と0.99の直線パターンを見せた。両者の結果とも，開始材料の量の差異を反映している。これらの結果は，本キットでの核酸の精製量は，開始材料の量と緊密に相関することを示唆している。これは，遺伝子発現の研究において，最も基礎的に要求されるものの一つである。

DNAのコンタミネーション試験
　mRNAが様々な量のマウス組織（脾臓と肝臓）から，ホモジェナイズ法としてRobolyserを使用して分離され，DNAコンタミネーションの可能性をチェックするため，サイクロフィリンAの遺伝子が増幅された。RTステップを含まないコントロールPCRを，脾臓と肝臓から精製したmRNAに対して行った（図5）。ライトサイクラーのグラフはフラットな線示しており，mRNAにおけるDNAの不含が確認された。これらの結果から，本キットでの分離mRNAの高品質性が確認された。正確な遺伝子発現における定量RT-PCRは，DNA-フリーのmRNAに実際に依存している。

アッセイ間の変動分析
　15 x 10 mgの肝臓からmRNAが分離され，ターゲットとしてサイクロフィリンAの転写産物を使用してRT-PCRで分析した。機器の変動（ライトサイクラーやMagNA Pure LC）を避けるために，15本の単一の溶出物と，溶出物をプールしたもの15本を分析した（図6）。

結論
　MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）のMagNA Pure LC機器での性能がこの記事で述べられました。mRNAは凍結マウス組織の様々な量とタイプ（1-10 mgの脾臓，肝臓，腎臓）より分離されました。様々なテストを使用しての分離mRNAの分析は，応用された精製過程が，高品質で，出発材料を反映した量での核酸の精製を行っていることが示唆されました。分離されたmRNAは効率的なDNase分解ステップによりDNAフリーでした。凍結組織から精製されたmRNAの性能が，この機器とキットの組み合わせを，遺伝子発現分析の分野における正確で信頼性の高いツールとします。