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Gene Expression コーナー |
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細胞培養をより簡単に：ジェネティシン（G-418）溶液タイプと FuGENEトランスフェクション試薬 |
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| Manfred Watzele and Claudia Kirr Roche Applied Science, Penzberg, Germany |
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特長 ●使いやすい50mg/mlの濃度で供給されます。 ●フィルター滅菌済みで、細胞毒性のある成分を含みません。 ●100μg/mlの濃度で90%のトランスフェクション細胞が選択できます。 ●FuGENE 6やFuGENE HDトランスフェクション試薬との組み合わせで1週間以内に、迅速にトランスフェクション細胞の選択が可能です。 イントロダクション 選択マーカーによるステーブルトランスフェクション アミログリコシド系の抗生物質であるG-418は、細胞のトランスフェクション実験での選択剤として使用されます。G-418の構造はゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシンと類似していますが、これらの成分とは違い、80Sリボゾームの機能に干渉し、真核細胞のタンパク質合成をブロックします[1-3]。アミログリコシド系の抗生物質は、トランスポゾンTn5とTn601（903）にコードされている、バクテリアのアミログリコシドホスフォトランスフェラーゼAPH（3'）IIとAPH（3'）Iにより不活化されます。ネオマイシン耐性遺伝子（neo）の細胞へのトランスフェクションは、細胞をG-418耐性（neor）にし、G-418を含む培地での増殖を可能にします。この選択はほとんどすべての細胞で使用できます。 新製品のG-418溶液タイプは50mg/mlの濃度のフィルター滅菌済み製品で、使用がより簡便になっています。また有害なG-418粉末の秤量が必要ないので、安全性も高まります。 材料と方法 G-418の薄層クロマトグラフィー 各メーカーからの50μgのサンプルを50mg/mlの濃度で再蒸留水に溶解し、10×10cmにカットしたシリカゲル60TLCプレート（Merk #105735.001）にアプライしました。プレートをEtOH：1-ブタノール：NH4OH（25％）を1：1：1（v/v/v）とした溶媒システムで、溶媒がプレートの先端に届くまで展開しました。プレートを乾燥させた後、スポットをiodine vapor染色や0.3％ニンヒドリン溶液へ浸し、110℃で5分間乾燥させることで可視化しました。 G-418使用濃度の決定 PC-3細胞を2mMグルタミンと10% FCSを含むRPMI-1640中で増殖させ、24ウェルプレートに5×104細胞/ウェルの密度で播種しました。播種の1日後、終濃度50μg/ml〜1000μg/mlの様々な濃度でG-418溶液を加えました。増殖は、G-418への暴露後3日目に細胞増殖試薬WST-1で測定しました。G-418の添加の3日後に、細胞を洗浄しトリプシン処理の後、その4分の1を前と同じG-418濃度の新鮮な培地に播種しました。4日後、増殖率を再度測定しました。 FuGENE 6によるPC-3細胞のトランスフェクション PC-3細胞を2mMグルタミンと10% FCSを含むRPMI-1640中で増殖させ、トランスフェクションの1日前に24ウェルプレートに5×104細胞/ウェルの密度で播種しました。トランスフェクションを行う日には、細胞密度は40%で、トランスフェクションコンプレックスを培地に直接加えました。コンプレックスは以下の通りに調製しました：0.6μlのFuGENE 6と0.3μgのGFPとネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドを25μlのDMEMに加え、室温で15分間インキュベートしました。 トランスフェクション細胞の選択 トランスフェクションの1日後、終濃度50μg/ml〜1000μg/mlのG-418溶液による選択を開始しました。増殖はG-418への暴露後3日目に細胞増殖試薬WST-1で測定しました。それと並行して、蛍光細胞を計数しました。G-418の添加の3日後に、細胞を洗浄しトリプシン処理の後、その4分の1を前と同じG-418濃度の新鮮な培地に播種しました。4日後、蛍光細胞を計数し、増殖率を再度測定しました。 結果と考察 G-418の純度 真核細胞の選択剤としてのG-418の重要な規格として、純度と均一性、確立されたトランスフェクションと選択プロトコールでの使用を可能とする信頼できる活性です。G-418にはしばしば他の成分が夾雑し、望ましくない細胞毒性の副次効果がこれらの夾雑物により起こります。 我々は、新製品のG-418溶液を他のメーカーの製品と比較しました。夾雑物と同様G-418も色や蛍光を発さないため、様々な成分を簡単には検出できません。それゆえ、我々は2種類の染色法を採用しました。図1に見られる薄層クロマトグラフィーはニンヒドリンで染色され、あるG-418サンプルには無視できない量の夾雑物が検出されました。他のサンプルも少量の夾雑物が見られましたが、ロシュ・ダイアグノスティックスのG-418溶液はほとんど純粋でした。 使用濃度の決定 ドースレスポンスカーブにより、様々な濃度のG-418溶液の接着PC-3細胞への増殖停止能が試験されました。G-418溶液の効果は3日後に観察（図2b）され、250〜500μg/mlで、未トランスフェクションPC-3細胞の増殖の完全なブロックが観察されました。 G-418溶液によるトランスフェクション細胞の選択 ネオマイシン耐性遺伝子とeGFP遺伝子を持つプラスミドによる、PC-3細胞のトランスフェクション後の選択操作の最適条件を決定するために、G-418濃度を50〜1000μg/mlの間で細胞にアプライしました。最初の選択後、未トランスフェクション細胞の増殖率は、>100μg/mlの濃度で大きく減少しました（図3a）。>500μg/mlの濃度では、>80%の細胞がGFPマーカーを持っていました（図3b）。未トランスフェクション細胞中では、そのレベルはわずか40%でした（図5a）。2回目の選択では、>500μg/mlのG-418で培養されたすべての細胞で蛍光を発していました（図5b）が、G-418不含あるいは50μg/ml濃度で保持された細胞は、eGFPを発現する能力を部分的に失っていました（図4b）。 結論 新製品のG-418溶液は低濃度でも作動します：100μg/mlのG-418で90%のトランスフェクション細胞を選択するのに十分です。WST-1アッセイでの測定のように、新製品のG-418溶液はすべての濃度で、他のメーカー品よりも高い増殖率を示しました（図3aと4a）。この最も高い増殖率は、G-418溶液には細胞毒性成分が夾雑していないことの更なる保証です。 フィルター滅菌溶液という製品の形状は、操作ステップを最小限にし、非常に簡便です。FuGENE 6やFuGENE HDトランスフェクション試薬との組み合わせにより、PC-3細胞株で見られたように、1週間以内で迅速にトランスフェクション細胞の選択が可能です。 リファレンス 1．Eustice DC, Wilhelm JM（1984）Antimicrob Agents Chemoter 26：53-60 2．Xu M, Stavnezer J（1992）EMBO J 11：145-155 3．Bar-Nun S et al.（1983）Biochim Biophys Acta 741：123-127 4．Anhalt JP, Brown SD（1978）Clin Chem 24：1940-1947 |
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BIOCHEMICA2006NUMBER2(No103) |
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