GS FLX チタニウムシリーズを用いたアンプリコンシークエンシング

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ゲノムシークエンサーFLXシステム（以下、GS FLXシステム）を使用する事で、アンプリコンターゲット中の一分子のアンプリコンのシークエンスを行う事が可能となります。この方法では、各々のアンプ リコン分子（いわゆるPCR産物）は個々に配列決定されます。そして、アンプリコン配列をすべてカバーすることで、ハプロタイプ情報や、稀な突然変異の同 定が可能です。GS FLXシステムは、エマルジョンPCRステップによって何十万分子を簡便にクローニングを行うことが可能です。これはサンガー法でPCR産物をダイレクト にシークエンシングを行い、混合物の平均的な配列を決定するのとは対極に位置します。

Figure 1: GS FLX Titanium Series Amplicon Sequencing. The composite primers each comprise a 25-bp sequence (Primer A or Primer B) which will be used in sub-sequent clonal amplification and sequencing reactions at their 5'-end, fused to a typically 20- to 25-bp target-specific sequence at their 3'-end.

GS FLX チタニウムシリーズ（Fig.1）において、アンプリコンシークエンシングキットとプロトコール導入は、多様な生物学の分野で、数多くの研究アプリケー ションを使用可能にします。Titaniumシリーズにより伸長したリード長は（多くのアンプリコンは400-500bpで形成されます）、少ないローカ スを有すアンプリコン分子を完全にカバーし、稀なバリアントやハプロタイプの検出力をあげることで、ターゲット領域のリシークエンシングを改善します。ま た、GS FLXシステムで提供されるAmplicon Variant Analysisソフトウェアは、参照配列に対して、アンプリコン由来の試料から得られる解析リードを自動的にアライメント計算します。

アンプリコンシークエンシングは、以下の3つの主要なアンプリコン研究に分類することができます。

Ultra-deep sequencing

　

Ultra-deep sequencingは、標的配列をより深くカバーしてシークエンシングすることで、普遍的あるいは稀な塩基の違いを確認することができます。十分な深度 をもった配列データでは、1%未満の稀な配列の違いを特徴づける能力があります。（1、2、3）

Ultra-broad sequencing

　

Ultra-deep sequencingとは対照的に、Ultra-broad sequencingは、浅い深度で異なるアンプリコンの集合体の配列決定が可能です。この例として、ヘテロ接合体のSNPをエキソン全般に渡って配列決定を行うことも可能です。（4）

16S rRNA sequencing

　

特に多様なメタゲノムサンプルにおいて、16SのrRNA遺伝子に標的を絞ったシークエンシングは、細菌の系統発生と分類学を勉強する一般の方法です。
　慢性傷と人間の唾液に、北太平洋の海の深い海から、この方法は、種々の環境下において細菌の多様性を調査するのによく用いられてきました。（5）

以上の通り、GS FLXシステムを用いたアンプリコンシークエンシングは、特に臨床研究において幅広い科学的見地を発見することが可能な方法です。さらに、GS-FLXチ タニウムケミストリーとアンプリコンシークエンシングプロトコールを導入することでさらにアプリケーションが広がっていきます。

リファレンス

1. Simen et al. （2009） J Infect Dis 199:693-701
2. Margeridon-Thermet et al. （2009） J Infect Dis 199:1275-1285
3. Campbell et al. （2008） PNAS 105:13081-13086
4. Bordoni et al. （2008） BMC Genomics 9:464
5. Turnbaugh et al. （2009） Nat Biotechnol 45 7:480-484

BIOCHEMICA2009 NUMBER4 (No117)