Transcriptor One-Step RT-PCR Kit － 高感度なRNA検出に －

Gene Expression Corner

Renate Kolb, Waltraud Ankenbauer, and Brigitte Hloch^*
Roche Applied Science, Penzberg, Germany
^*Corresponding author: brigitte.hloch@roche.com

イントロダクション

ワンステップRT- PCRは、RNAの有無を検出したり、mRNAの発現レベルを定量する高感度な方法です。また、希少なmRNAをクローニングする際のRT-PCRにも用 います。ワンステップRT-PCRは操作ステップを最小限に抑えることで、反応間のばらつきやコンタミネーションのリスクを低減することができます。 Transcriptor One-Step RT-PCR Kitは、従来から好評を頂いているTranscriptor Reverse TranscriptaseをワンステップRT-PCRフォーマットに組み込んだ製品です。このキットは、遺伝子特異的プライマーを用いたスピーディで高 感度、高再現性のエンドポイントRT-PCRのためにデザインされています。革新的な反応バッファーを採用し、GCリッチなRNAテンプレートなど様々な テンプレートの増幅に適したホットスタートPCRシステムになっています。このキットは高感度で高収量なTranscriptor Reverse Transcriptaseと、高正確性で高収量なExpand Systemの組み合わせです。テンプレートとしてトータルRNAやmRNA、in vitro 転写RNA、ウイルスRNAなど様々なRNAが使用できます。

酵素ミックス

Transcriptor Enzyme Mixは4種類の酵素を含んでいます。高感度で高収量なTranscriptor Reverse Transcriptase、高温でも完全な活性を示し逆転写反応中もRNAを保護するProtector RNase Inhibitor、PCRでの正確性と収量を向上させるプルーフリーディングポリメラーゼとTaq DNA PolymeraseのミックスであるExpand Systemが含まれます。

反応バッファー

RT-PCR Reaction Bufferは、高品質なdNTPミックスを含み、ホットスタートPCRシステムのパフォーマンスを向上します。低温時にはバッファーのユニークなホット スタートPCR用成分がプライマーに結合し、非特異的な増幅を抑制します。また、温度依存的にマグネシウムに結合し、DNA合成を抑制する物質も含まれて います。このRT-PCR Reaction Bufferは逆転写反応やPCRの間、特異性と感度を効果的に向上させ、さらにプライマーダイマーの発生を低減します。

Transcriptor One-Step RT-PCR Kitの特長

• 高い感度と収量が得られます。1 fgのトータルRNAや1コピーのウイルスRNAを検出することが可能です（図1、図2）。
• 高い特異性により、プライマーダイマーの発生が抑えられます。ホットスタートPCRバッファーにより、キットのパフォーマンスが向上します（図2）。
• 長鎖断片を合成できます。6.5kbまでの増幅が確認されています（図3）。
• 様々なテンプレート（GCリッチなど）から逆転写できます。Transcriptor Reverse Transcriptaseと専用バッファーで、複雑な高次構造をもつテンプレートも克服できます。
• 反応時間を短縮し結果を改善します。ピペッティングステップ数を最小限にし、コンタミネーションのリスクを低減できます。
• RNAサンプルを完全に保護できます。Protector RNase Inhibitorは、ワンステップRT-PCRの間、RNaseによる分解からRNAサンプルを保護します。
• 結果の信頼性が向上します。キットに同梱のコントロールテンプレートとコントロールプライマーを用いてキットのパフォーマンスをモニタリングできます。

図1：逆転写困難なテンプレートを高感度に逆転写します。
このキットで、HeLaの 様々な量のトータルRNAをテンプレートにして逆転写しました。28SリボソーマルRNA特異的なプライマーを用いて、このキットのスタンダードなプロト コール（逆転写反応 50℃、30分）で389 bp断片（GC含有率64%）を増幅しました。アガロースゲル電気泳動で得られたバンドは、少量のテンプレート（1 fg）から高感度にシグナルが得られたことを示しています。

図2：Transcriptor One-Step RT-PCR Kitの高い感度と高い特異性
ヒト28SリボソーマルRNAの389 bp断片（a）、ヒトApoBの2.5 kb断片（b）はTranscriptor One-Step RT-PCR Kitや他社ワンステップRT-PCRキットで増幅できました。Transcriptor One-Step RT-PCR Kitは、他社キットと比較して幅広いサンプル量でより高感度に、より高特異的に増幅できています。

図3：6.5kbまでの断片の増幅
Transcriptor One-Step RT-PCR Kitを用いて様々な量のトータルRNAやウイルスRNAが逆転写できました。サンプル： 10⁶コ ピーのHepatitis Aウイルス（HAV）RNA（246 bp）、様々な組織由来の10 ngのトータルRNA、K562細胞のトータルRNA（139 bp、387 bp、587 bp、1.8 kb）、様々な組織やHeLa細胞の100 ngのトータルRNA（2.5 kb、3.6 kb、5.3 kb、6.0 kb、6.3 kb）。Transcriptor One-Step RT-PCR Kitは幅広いサイズの断片を効率的に増幅できています。

Coming Soon!

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
Transcriptor One-Step RT-PCR Kit	4655877	50回反応	¥43,500
	4655885	150回反応	¥111,000

BIOCHEMICA2009 NUMBER1 (No114)