FuGENE® HDトランスフェクション試薬を使用したルシフェラーゼレポーターアッセイのためのDNAとRNAによるVeroE6細胞の効率的なトランスフェクション

Protein Expression Corner

Andrea Paluschkiwitz, Katharina Keisers, Karin Fleβner, Marijana Gelo, Frank T. Hufert, and Martin Spiegel^*
Institute for Virology, University Clinic, Göttingen, Germany

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
FuGENE® HDトランスフェクション試薬	4 709 691	0.4 ml	←製品番号をクリック
	4 709 705	1 ml	←製品番号をクリック
	4 709 713	5×1 ml	←製品番号をクリック

イントロダクション

ほ乳細胞のインターフェロン（IFN）システムは、ウイルス感染に対する最初の防御ラインです。感染に続き、非修飾5'-三リン酸末端を持つ二重鎖 RNAや一本鎖RNAなどの危険なシグナルが、膜結合型Toll-likeレセプターや細胞質レセプター（MDA5、RIG-I）により認識されます。こ れはタイプIインターフェロンの産出を促すシグナルカスケードを誘導します。IFN-α/βレセプターを介するオートクリンおよびパラクリン刺激により、 感染細胞やその周辺の細胞において抗ウイルスタンパク質の発現が誘導されます。多くのウイルスは、その標的細胞への感染を成功させるために、このシステム を回避するインターフェロンアンタゴニストと呼ばれるタンパク質を発現します。ウイルス遺伝子産物がIFNに拮抗する機能を持つかどうかを評価する便利な ツールとして、IFNシステムに特異的なプロモーター（ヒトIFN-βプロモーター）により派生するルシフェラーゼ発現におけるウイルスタンパク質の影響 を測定する、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイがあります。プロモーターの活性化がウイルスタンパク質の存在下でブロックされるとき、ルシフェラー ゼ活性の上昇は観察されず、拮抗的な機能が示唆されます。しかしながら、ウイルスタンパク質やトランスフェクション試薬に起因する細胞毒性などによるルシ フェラーゼ発現への非特異的な効果は、結果の評価を間違えないために、排除されなければなりません。このために、構造的に活性なプロモーターのコントロー ル下に置かれた第2のレポーターとの共発現を、細胞活性やトランスフェクション効率のモニターに使用することができます。

FuGENE^® HDトランスフェクション試薬をVeroE6細胞のトランスフェクションに使用したとき、高いルシフェラーゼ活性とIFN-βの強い活性化が達成されました。それ以上に、FuGENE^® HDの効率は使用した細胞数と相対的に関係はなく、リポソームをベースとするトランスフェクション試薬と比較して低い細胞毒性でした。

材料と方法

トランスフェクションの1日前に、VeroE6細胞（DSMZ，Germanyより供与）を12ウェルプレートに播種し、10％ FCS、2 mM L-グルタミン、100 Uのペニシリン/100μgのストレプトマイシンを含むDMEM中で培養しました。細胞は500 ngのp125-luc（ヒトIFN-βプロモーターにコントロールされた蛍ルシフェラーゼ、京都大学のT. Fujitaより贈与）と12.5 ngのpRL-SV40（構造的に活性なSV40アーリープロモーターのコントロール下に置かれたウミシイタケルシフェラーゼ、Promega、 Germany）、500 ngの推定上のウイルス拮抗物質を発現するプラスミドを、3μlのFuGENE^® HDあるいはリポソームをベースとする市販のトランスフェクション試薬を使用して、コトランスフェクションしました。トランスフェクションの24時間後、 細胞を2μgのVSV感染VeroE6細胞から分離したRNAで再度トランスフェクションすることで、刺激しました。また別に、細胞をVSV非感染 VeroE6細胞から分離したRNAでトランスフェクションしましたが、IFN-βプロモーターの活性化には影響を与えませんでした。刺激の18時間後に 細胞を採取し、Fluostar Optimaマイクロプレートリーダー（BMG Laabtech、Germany）を使用してルシフェラーゼ活性を測定しました（Dual Luciferase assay system、Promega）。

結果と討論

最初に、我々はトランスフェクション試薬量、ルシフェラーゼ発現プラスミド、刺激に用いるRNAが決まっているときに、トランスフェクション効率におけ る細胞数の影響を比較しました。VSV感染VeroE6細胞からのRNAで刺激した細胞は、非感染細胞のRNAでトランスフェクションした細胞に比べて、 ルシフェラーゼ活性の強い増加を示し、IFN-βプロモーターの活性化が示唆されました（図1、上部パネル）。注目すべきことに、FuGENE^® HDでトランスフェクションされた細胞のIFN-βプロモーター活性の増加は、リポソームをベースとするトランスフェクション試薬が9-14倍であるのに比べ、14-25倍でした。VSV感染細胞からのRNAをFuGENE^® HDでトランスフェクションした後、非感染細胞からのRNAをトランスフェクションしたときに比べ、ウミシイタケルシフェラーゼ活性のわずかな減少のみが 観察されました（図1a、下部パネル）。しかしながら、リポソームをベースとするトランスフェクション試薬でトランスフェクションされた細胞では、少数の 細胞（0.5×10⁵個/ウェル）が使用されたとき、VSV感染細胞からのRNAによる刺激の後で、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の明瞭な減少が観察されました。それに付け加えて、FuGENE^® HDではウミシイタケ活性と細胞数に相関はない（図1a、下部パネル）のに、リポソームをベースとしたトランスフェクション試薬では、細胞数を増加させてもウミシイタケルシフェラーゼ活性の減少が見られました（図1b、下部パネル）。それ以上に、FuGENE^® HDでトランスフェクションした細胞のホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性は、リポソームをベースとした試薬に比べて少なくとも10倍は高くなりました。これらのことから、FuGENE^® HDによるVeroE6細胞のトランスフェクションは、少ない細胞数においてもより低細胞毒性で、使用する細胞数の変動にも強く、より効率的でした。
その低細胞毒性と高効率のため、FuGENE^® HDを以下の実験に使用しました。ケニア出血熱ウイルス（RVFV）の非構造的タンパク質NSsの、ヒトIFN-βプロモーターの活性化における効果を実 験しました。RVFV-NSsの共発現は、VSV感染･非感染細胞からのRNAをトランスフェクションした細胞中のホタルルシフェラーゼ活性を劇的に減少 させます（図2a、上部パネル）。見たところでは、RVFV-NSsはすでにIFN-βプロモーターの基底的な活性を低下させ、このブロックは、VSV感 染細胞からのRNAで刺激された細胞で、いまだ効果的でした。RVFV-NSsの発現はまた、構造的に活性なSV40アーリープロモーターにより派生する ウミシイタケルシフェラーゼの発現にも強い効果を持っており、これはRVFV-NSsの阻害機能がIFN-βプロモーターに制限されないことを示唆してい ます。ルシフェラーゼ活性の減少が大量の細胞死によるものとすることはできないようです。なぜならRVFV-NSs発現コンストラクトのトランスフェク ション後には、細胞数のはっきりとした減少が見られないためです。興味深いことに、RVFV-NSsは、プラスミドDNAの代わりにin vitro転 写したルシフェラーゼRNAをトランスフェクションしたときには、ルシフェラーゼ活性に影響を与えませんでした（図2b）。このことはタンパク質の翻訳は ウイルスタンパク質に影響されないことを示唆しています。代わりに、RVFV-NSsの阻害機能は転写レベルで起こっているようでした。このことは、 RVFV-NSsがRNAポリメラーゼII転写コンプレックス、基本的な転写因子TFIIHの一成分を標的としている事実からも説明できます。それに加 え、RVFV-NSsは細胞因子SAP30に結合し、IFN-βプロモーターの点で転写因子YY1とコアクチベーターCBPのリクルートを妨害します。 TFIIH、SAP30、YY1はIFNシステムに特異的な成分ではありませんが、レポーターアッセイにおいて観察されるIFN-βプロモーターの活性化 の阻害はアーティファクトではなく、in vivoでの妥当なものです：NSsを発現しているRVFVのみが、IFN-コンピテントマウス 中で複製され、NSs遺伝子に大きな欠失のあるウイルスミュータントは複製されません。興味深いことに、このミュータントはIFN-α/βレセプターを欠 くノックアウトマウス中で、野生型と同様に複製されます。このことは、NSsはウイルスがIFNシステムに対抗する際にのみ必要とされることが示唆しています。

結論

FuGENE^® HDトランスフェクション試薬はデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、DNAと同様にRNAも効率よくVeroE6細胞にトランスフェク ションしました。高いトランスフェクション効率と低毒性の組み合わせは、すべてのルシフェラーゼ活性を上昇させ、IFN-βプロモーターに制御されたルシ フェラーゼの発現を強く誘導しました。このシステムを使用することにより、RVFVのNSsタンパク質は構造的に活性なSV40アーリープロモーターと同 様に、ヒトIFN-βプロモーターの強力なインヒビターであると特徴付けられました。

リファレンス

1. Haller O et al. （2007） Curr Top Microbiol Immunol 316:315-334
2. Le May N et al. （2004） Cell 116:541-550
3. Le May N et al. （2008） PLoS Pathog 4:e13
4. Bouloy M et al. （2001） J Virol 75:1371-1377

FuGENE^®はFugent, LLC., USAの登録商標です。

図1：VeroE6細胞でのIFN-βプロモーターとSV40アーリープロモーター依存性のルシフェラーゼ発現。
（a）FuGENE^® HDでトランスフェクションされた細胞。
（b）リポソームベースのトランスフェクション試薬でトランスフェクションされた細胞。

図2：ルシフェラーゼ発現におけるRVFV-NSsの効果。
（a）ルシフェラーゼ発現プラスミドでトランスフェクションされた細胞。
（b）ルシフェラーゼRNAでトランスフェクションされた細胞。

BIOCHEMICA2008 NUMBER2 (No111)