HelpCorner　-　核酸の抽出と精製に関するFAQs

Gene Expression Corner

ここに記載したFAQs（Frequently Asked Questions）はオンラインFAQsから抜粋したものです。

RNAの抽出

FAQ: ホルマリン固定パラフィン包埋組織からのRNA抽出にお勧めのキットを教えてください。
HelpCorner: High Pure FFPE RNA Micro Kitをお勧めします。色々な組織からのRNA抽出例は表1をご覧ください。抽出したRNAの品質は図1をご覧ください。

表1：抽出RNAの収量と260nm/280nm OD比

5μm スライス組織	High Pure FFPE RNA Micro Kit	Supplier A	Supplier B
異種移植片	1.5μg OD 2.0	1.4μg OD 1.9	n. a.
ラット脳	1.0μg OD 2.0	0.9μg OD 1.9	1.2μg OD 2.1
乳房腫瘍1	1.0μg OD 1.9	0.8μg OD 1.8	0.6μg OD 2.1
乳房腫瘍2	3.5μg OD 2.0	2.4μg OD 2.0	3.1μg OD 2.0

図1：抽出RNAの品質
3種類の抽出キットを用いて同一サンプル（乳房腫瘍）から抽出したRNAの電気泳動

FAQ: 酢酸アンモニウムを用いたRNAのエタノール沈殿にグリコーゲンを使用する際、沈殿がやや茶色がかって見えます。これは問題でしょうか？また、グリコーゲンが含まれる場合、RNAを再溶解し難くなりますか？
HelpCorner: グリコーゲンは全く不活性の多糖類で、どのような反応にも影響しません。そのため、一般的に精製した核酸からグリコーゲンを取り除く必要はありません。沈 殿したペレットは白くなりますが、正確な色合いは沈殿の状態に依存します。風乾させたペレットは再溶解し易いのですが、真空乾燥させたペレットは若干再溶 解し難くなります。再溶解が難しい場合は、ピペッティングやボルテックスを用いて再溶解します。

FAQ: in vitro転写実験の際、まれにテンプレートが完全に切断できない場合があります。in vitro転写実験において、環状DNAに注意する必要はありますか？
HelpCorner: はい。環状プラスミドDNAやニックプラスミドDNAは、in vitro転 写反応に干渉します。転写効率を悪くしたり、非特異的転写産物を合成します。制限酵素で確実に切断するには、精製されたDNAを使用することが理想的で す。例えば、High Pure Plasmid Isolation Kitを用いてテンプレートプラスミドDNAを精製し、1μgのテンプレートDNAあたり10ユニットの制限酵素を用いて3時間以上反応させます。塩やタ ンパク質、RNaseなどのコンタミネーションがない、精製度の高いテンプレートを用いることが重要です。さらに、直鎖化したテンプレートについては、ゲ ル精製とスピンカラム（High Pure PCR Product Purification Kitなど）を使用した精製をお勧めします。
フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿も推奨されます。テンプレートDNAはRNaseフリーの水（PCRグレード水）で再溶解し、ゲル上で断片のサイズや精製度、濃度を確認し、1μgをテンプレートとしてin vitro転写反応に用います。

FAQ: RNAの保存方法について、最適な温度や最適なエタノール濃度を教えてください。
HelpCorner: 短期間の保存であれば、RNaseフリーのTEバッファー（10 mM Tris, 1 mM EDTA）やRNaseフリーの水（0.1 mM EDTA含む）中に溶解し、-20℃で保存します。
注意：RNaseフリーにするためには、EDTA溶液の使用が重要です（古いEDTA溶液は、細菌繁殖の可能性があり、ヌクレアーゼのコンタミネーションが考えられます）。一般的に、RNAは-80℃で一年以上安定して保存できます。

長期間の保存であれば、エタノール沈殿の状態で-80℃以下で保存します。
注意：RNAは、-80℃で酢酸アンモニウム/エタノール沈殿の状態が最も安定しています（水やバッファーに溶解したRNAも-80℃で保存できる）。酢酸アンモニウム沈殿（0.1倍量の5 M NH₄OAcと 2.0～2.5倍量の100%エタノール、-20℃で25分間以上）は、十分なRNA回収量が得られます。低濃度のRNA（ng/ml）を定量的に回収するには、不活性の共沈剤（グリコーゲンやtRNAなど）を使用します。

精製したRNAの他の保存方法

ペレットとして70%エタノール中で保存するか、2倍量の100%エタノールで保存します。
酢酸ナトリウムを加えて遠心し、RNAを回収します。

複数のチューブに分注して保存することをお勧めします。凍結融解によるダメージを抑え、RNase混入のリスクを分散します。

RNAの回収と再溶解

遠心の後、ペレットを37℃で風乾させるか、真空乾燥させます。
注意：RNAを完全に乾燥させると再溶解し難くなるので、完全に乾燥させないように注意します。室温下のRNAは分解の影響を受け易いた め、作業中のRNAサンプルは常に氷上に置きます。RNaseフリーのTEバッファー（10 mM Tris, 1 mM EDTA）かRNaseフリーの水（0.1 mM EDTAを含む）を加え、氷上で15分間インキュベーションしてRNAを再溶解します。軽くタッピングするか、注意してボルテックスします。

RNAの沈殿

精製したRNAは次の実験に用いるために沈殿により濃縮する必要があります。酢酸アンモニウム沈殿（0.1倍量の5 M NH₄OAcと 2.0～2.5倍量の100%エタノール、-20℃で25分間以上）は、十分なRNA回収量が得られます。低濃度のRNA（ng/ml）を定量的に回収するには、不活性の共沈剤（グリコーゲンや酵母RNAなど）を使用します。
注意：RNase阻害剤（Protector RNase Inhibitorなど）は、RNA抽出ステップやRNA精製ステップはもちろん、逆転写反応やin vitro転写反応などにも使用できます。

DNAの抽出

FAQ: 30bpのPCR断片の精製にお勧めのキットを教えてください。
HelpCorner: DNA断片長により選択的（25～100bp）にDNA断片を精製するには、High Pure PCR Cleanup Micro Kitをお勧めします。このキットは、Binding BufferとBinding Enhancerを含んでおり、これらを混ぜ合わせることで各実験に適した結合条件に調整できます。Binding Enhancerを加えない場合、プライマーやプライマーダイマーを除去できます。Binding Enhancerの割合を増やすと、小さいDNA断片の回収量の増加が図れます。

FAQ: High Pure PCR Template Preparation KitのElution Bufferは、Trisは含んでいますがEDTAを含んでいません。長期間（5～10年）DNAを保存する場合、DNAの安定性が心配です。
HelpCorner: High Pure PCR Template Preparation Kitで抽出したゲノムDNAを長期間保存する場合、分注して-20℃で保存すると5～10年間はダメージを受けずに保存できます。数ヶ月程度なら Elution Buffer中で4℃で保存できます。

FAQ: High Pure PCR Template Preparation Kit：グラム陽性菌の細胞壁を効果的に破壊する方法を教えてください。
HelpCorner: グラム陽性菌の細胞壁は様々です。破壊し難い細胞壁を持つ種の場合、下記のいずれかの方法をお勧めします。
液体窒素を用いて、凍結融解を3回繰り返す。
超音波処理を行う。
2倍量のLysozymeを加えるか、様々な量のLysozymeを加える。
Proteinase Kの量や処理時間を増やすか、Lysis Bufferを加える前にProteinase K処理（50ユニット、30分間）を行う。
注意：必ずサンプルがどのタイプの菌か考慮します。
次のリファレンスはS. aureusからのDNA抽出について書かれています。

リファレンス

1. Templeton KE et al. (2003) J Clin Microbiol 41:4016-4021

さらに多くのFAQがウェブサイトからご覧頂けます。
www.roche-applied-science.com/techresouces

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
Glycogen	901 393	20 mg（1 ml）	←製品番号をクリック
High Pure FFPE RNA Micro Kit	4 823 125	50回	←製品番号をクリック
High Pure Plasmid Isolation Kit	1 754 777	50 回	←製品番号をクリック
	1 754 785	250 回	←製品番号をクリック
High Pure PCR Product Purification Kit	1 732 668	50 回	←製品番号をクリック
	1 732 676	250 回	←製品番号をクリック
tRNA（E. coli MRE600）	109 541	100 mg	←製品番号をクリック
	109 550	500 mg	←製品番号をクリック
Protector RNase Inhibitor	3 335 399	2,000 U	←製品番号をクリック
	3 335 402	5×2,000 U	←製品番号をクリック
High Pure PCR Cleanup Micro Kit	4 983 955	50回	←製品番号をクリック
	4 983 912	200回	←製品番号をクリック
High Pure PCR Template Preparation Kit	1 796 828	100回	←製品番号をクリック
Lysozyme	837 059	10 g	←製品番号をクリック
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	3 115 887	1.25 ml	←製品番号をクリック
	3 115 828	5 ml	←製品番号をクリック
	3 115 844	25 ml	←製品番号をクリック
	3 115 836	25 mg	←製品番号をクリック
	3 115 879	100 mg	←製品番号をクリック
	3 115 801	2×250 mg	←製品番号をクリック
	3 115 852	4×250 mg	←製品番号をクリック

BIOCHEMICA2008 NUMBER1 (No110)