FuGENE® 6トランスフェクション試薬：遺伝子パスウェイを研究するためのハイスループット実験ツール

Protein Expression Corner

Nathan D. Trinklein and Shelley Porce Aldred
SwitchGear Genomics, Menlo Park, CA, USA

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FuGENE® 6トランスフェクション試薬	1 815 091 1 814 443 1 988 387	0.4 ml 1 ml 5×1 ml	←製品番号をクリック

イントロダクション

ポストゲノムの時代は、ゲノム研究におけるハイスループットの進歩を導きました。マイクロアレイによる発現分析や、転写因子結合アッセイであるチップ上 でのクロマチン免疫沈降法（ChiP-chip）などのゲノミクスのアプローチは、遺伝子パスウェイにおける新しい知見をもたらしました。これらのテクノ ロジーは有用な観察データを提供しますが、ネットワークにおける機能的関係を同定したり、遺伝子調節の機構を説明することはできません。機能的プロモー ターアッセイのような実験に基づくレポータージーンは、遺伝子ネットワークの調節機構を理解するためのデータに、新たな知見を付加します。効率的で再現性 の高いトランスフェクション法は、これらのすべてのアッセイに要求されるものです。

数種類のタイプのデータの組み合わせの効力の例を図1に示します。チャート上に多数のポイントがあり、基本転写因子結合（このケースでは TAF250）、機能的プロモーター活性、内在性の転写産物レベルが相関しているという一般的な知識に合致しています。しかしながら、このパターンから外 れている例外こそが、最も興味深いものです。基本転写因子結合の証拠を示さない、高い内在性転写レベルとプロモーター活性を持つ遺伝子座は、TAF250 に依存しないプロモーターの候補です。同様に、弱い内在性の転写レベルを持ち、顕著な転写因子結合と強いプロモーター活性が対となっている遺伝子座は、転 写ターンオーバーのレベルを調節する因子の候補です。それゆえ、機能的プロモーターアッセイをスケールアップの方向へ持っていくことは大変重要です。以前 の研究での数百のプロモーターの機能研究において、FuGENE^® 6トランスフェクション試薬を用いての多数の細胞株のトランスフェクションが、ゲノム機能のアノテーションにおける最初の重要なステップでした（図2）。

調節因子機能のハイスループット研究に利用するために、われわれSwithGear Genomicsは様々な疾患関連パスウェイを網羅する、数千のヒトプロモーターのライブラリーを作成しています。SwithGearの調節因子ライブラ リーはルシフェラーゼレポーター技術を使用して構築され、細胞に基づく研究のために、FuGENE^® 6トランスフェクション試薬などと組み合わせたトランスフェクションの容易なツールとして入手できます。これらのツールは単一の実験において数千の調節因 子の機能測定を可能にします。SwithGearの機能的なツールの使用は、遺伝子ネットワークの新しいメンバーの同定を成功させます。また、単一のマー カーというよりはむしろ、化学成分がパスウェイ全体にどのように影響するかの詳細を知るための、効率的で経済的なスクリーニング用のツールとしても使用さ れます。これらの新しいスクリーニング用ツールは、現存のデータセットを増強し、特定のパスウェイにおける化学成分の作用機序を詳述する機能的アノテー ションを提供します。ハイスループット研究の成功を完全なものとするために、一定で効率的なトランスフェクション条件をその実験において確立しなければな りません。FuGENE^® 6トランスフェクション試薬はハイスループットの細胞アッセイに必要な、至適なトランスフェクション効率、低細胞毒性、高い再現性を提供します。

材料と方法

HT 1080細胞（ATCC^® CCL-121^™）を増殖させ、10% FCS、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含むAdvanced MEM中に播種しました。細胞は100μlの培地容量で3,750個／ウェルおよび30μlの培地容量で1,500個／ウェル（それぞれ96ウェルおよび 384ウェルフォーマット）、白色組織培養用プレートに播種し、5% CO₂中37℃で24時間インキュベーションしました。各96ウェルでのトランスフェクションには、1.67μlのプラスミド（30 ng/μl）と0.3μlのFuGENE^® 6トランスフェクション試薬、3.03μlのOptiMEMを混合し、室温で30分間インキュベートした後にウェルに加えました。384ウェルでのトランスフェクションには、1μlのプラスミド（30 ng/μl）と0.12μlのFuGENE^® 6トランスフェクション試薬、1.88μlのOptiMEMの構成比でした。

コントロール実験のために、細胞を5% CO₂中37℃で24時間インキュベーションし、アッセイを行いました。低酸素実験のた めに、トランスフェクションした細胞を8時間インキュベートし、100μMの終濃度になるようにDFOを加え、3、6、9、24、34時間のインキュベー ションを続けた後、ルシフェラーゼ活性を測定しました。各トランスフェクションとアッセイ実験を4回繰り返しました。

各ウェル中のルシフェラーゼ活性を測定するために、100μlあるいは30μlのSteady-Gloルシフェラーゼ試薬を細胞の入ったウェルに直接加 え、室温で振とうしながら15分間インキュベートしました。発光シグナルはLMax384ルミノメーターを使用し、2秒間の積算で測定しました。コント ロールパネルでは、ランダムに選択したコントロールコンストラクト断片の平均強度に対する、プロモーター活性を計算するために、コントロールコンストラク ト群の平均活性値で生データを補正しました。低酸素実験では、時間0秒時のプロモーター活性に対する誘導活性を評価しました。

結果と討論

高い再現性を持つデータを作成することは、トランスフェクションを含む細胞に基づくアッセイをスケールアップする際に必要です。このアプローチの再現性 を示すために、8種類のコントロール構築物（4種類の既知のプロモーターおよび4種類のランダムな遺伝子フラグメントをルシフェラーゼプラスミドに挿入） を個別に、FuGENE^® 6トランスフェクション試薬と挙動が評価済みのコンストラクトを使用して、384ウェルフォーマットにおいて各6回、培養ヒト細胞にトランスフェクション しました。第二の研究では96ウェルフォーマットにおいて、4種類の独立的に調製した、低酸素に対する細胞の応答に関与すると考えられているプロモー ター（LDHAプロモーター）を含むルシフェラーゼコンストラクトをトランスフェクションし、DFO（低酸素応答の活性剤として知られる）の添加後の活性 のタイムコースを測定しました。

図3は、ルシフェラーゼプロモーターアッセイの結果が、8種類のコンストラクトに関連した低い（一定の）変動係数（CV）で、高い再現性を持つことを示 しています。この実験はまた、広いダイナミックレンジを提供しています。陽性およびランダムなコントロールフラグメントの両方が、ヒトのプロモーターやラ ンダムな遺伝子断片サンプルでしばしば観察される活性範囲を表すために、選択されました。96ウェルフォーマットでの比較実験でも、よく似た結果が得られ ました（データ未掲載)。同様に、低酸素誘導実験は、ハイスループットフォーマットで構築されたトランスフェクションに基づく機能的プロモーターアッセイ がまた、誘導イベントのタイムコースの測定を可能にし、独立的なコンストラクトの調製間で均質であり、広いダイナミックレンジの結果を示しました。

結論

ハイスループットのトランスフェクションに基づく機能的プロモーターアッセイは、遺伝子ネットワークやパスウェイ研究の様々な部分も統合します。ここで示されたデータは、FuGENE^® 6トランスフェクション試薬を使用した単一の実験で数百から数千のプロモーターを、高い再現性と広いダイナミックレンジで行う能力があることを強調しまし た。数千のプロモーターを持つトランスフェクションの容易なプラスミドと、効率的で低細胞毒性、高度に再現性のあるトランスフェクション技術の組み合わせ により、多くの研究者がこのようなスケールアップ実験を行うことができます。

詳細は：www.switchgeargenomics.com

図1：転写産物レベル、転写因子の結合およびプロモーター活性の統合データ。
このグラフは96個の遺伝子座から集めた3つのタイプのデータを表しています： 1) x-軸は定量RT-PCRにより測定した内在性の転写産物のレベル、2) y-軸はクロマチン免疫沈降法により測定されたTAF250基本転写因子の結合、3) 円の直径で表示されるのは、プロモーター-ルシフェラーゼ活性測定による機能的プロモーター活性です。

図2：14種類の細胞中の600以上のプロモーターの活性。
この一連の実験において、我々はルシフェラーゼをベースとしたハイスループット機能的プロモーターアッセイを使用して、14種類の細胞株にわたる600個 以上のプロモーター活性を追跡しました。相対活性レベルはこのヒートマップに反映されています。組織特異的な振舞いを見せるものがより多いのと同時に、構 造的な活性を持つプロモーターが多数あることに注目してください。

図3：384ウェルフォーマットでのランダムに選んだコントロールと既知のプロモーター構築物の活性パネル。
4種類のランダムなゲノム配列（R1-R4）とそれぞれ強さが異なる4種類の既知のヒトプロモーター（P1-P4）の活性を、ルシフェラーゼをベースとす る機能的プロモーターアッセイで測定しました。384ウェルフォーマットにおいて6重検体のHT 1080細胞をFuGENE^® 6トランスフェクション試薬で構築しました。トランスフェクションの繰り返しは非常に再現性が高く、これらのデータはまた広いダイナミックレンジで均質的に測定されました。

図4：低酸素誘導でのLDHAプロモーター活性のタイムコース。
LDHAプロモーターに由来するルシフェラーゼベースのレポーター構築物の4回の独立的な調製品の活性を、DFOの低酸素応答の誘導後に測定しタイムコースを取りました。この実験はHT 1080細胞をトランスフェクションするために、FuGENE^® 6トランスフェクション試薬を使用して96ウェルフォマットで行われました。機能的プロモーターアッセイは4つの調製品に関して均質な結果が得られ、低酸 素条件においてLDHAプロモーターの行動に対する新しい知見が得られました。この実験は、このようなタイムコース実験を容易に数百のプロモーターに対し て拡張できるハイスループットフォーマットで構築できるという一例です。

MICA2007 NUMBER4 (No109)