FuGENE® HDトランスフェクション試薬を使用した293T細胞への効率的なレンチウイルスベクターのトランスフェクション

Protein Expression コーナー

Duran Ustek, Deniz Durali, and Esin Aktas
The Institute for Experimental Medical Research, Istanbul University, Istanbul, Turkey

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
FuGENE® HD トランスフェクション試薬	4 709 691 4 709 705 4 709 713	0.4 ml 1 ml 5×1 ml	←製品番号をクリック

　レンチウイルスは研究分野での遺伝子導入や遺伝子操作において強力なツールとなっています。トランスフェクション試薬の効率は高力価の組換えレンチウイルスを得るために最も重要なものです。ここでは、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬が高い効率でレンチウイルスベクターで293T細胞をトランスフェクションできることを示します。

イントロダクション

レンチウイルスベクターは遺伝子の導入や発現のための魅力的なベクターとなってきました。分裂しない細胞への合体と、in vivoでの 安定的な長期遺伝子発現を提供するレンチウイルスベクターの能力は、多くの研究アプローチでの望ましい性質です。新世代のレンチウイルスベクターシステム は、ウイルス遺伝子の組換え体を産生する危険性を抑えています。レンチウイルスのコンストラクトは、小水疱性口内炎ウイルス（VSV-G）やRoss River Virus（RRV）などの異なるエンベロープ糖タンパク質の偽型を作ることができます。VSV-Gエンベロープは幅広い宿主生物向性を持ちますが、 VSV-Gの毒性効果でトランスフェクション後に293T細胞を殺します。トランスフェクション試薬の効率は、293T細胞システムにおいて高力価の組換 えレンチウイルスを得るために最も重要です。この実験では、偽型VSV-G粒子を作るHIV-1派生レンチウイルスベクターをトランスフェクションするた めに、vif、vpr、vpu、nef遺伝子を欠失した第2世代のパッケージングプラスミド（pPAX2）とVSVのエンベロープをコードしているプラス ミド（pMDG）、レポーター遺伝子としてのeGFPをコードしているPLVTHMトランスファープラスミド（ジェノバ大学のDr. Tronoによる寄贈）にanti p210 bcr/abl shRNAを組み込んだものを、293T細胞に使用しました。レンチウイルスシステムでの293T細胞のFuGENE HDトランスフェクション試薬によるトランスフェクション効率を評価しました。

材料と方法

293細胞の培養

293Tヒト腎臓上皮細胞は組換えウイルスの便利な供給源です。293T細胞は、10%のウシ胎児血清、200 mMのL-グルタミン、10 mMのMEM非必須アミノ酸、100 mMのピルビン酸ナトリウム、100 U/mlのストレプトマイシン、100μg/mlのストレプトマイシン、500μg/mlのジェネティシン、5% CO₂を含むダルベッコ改変イーグル培地で維持されました。トランスフェクションの24時間前に、60 mm組織培養ディッシュ中で、4 mlの増殖培地中に2.5×10⁵個の細胞を播種しました。

トランスフェクション

pLVTHM anti-bcr/abl shRNA、pPAX2およびpMDG2プラスミドをトランスフェクション実験に使用しました。トランスフェクションは以下の通りに行いまし た：pLVTHM、pPAX2およびpMDG2を150μlの培地に溶解。DNA-トランスフェクションコンプレックスを作成するために、添加剤不含の MEMと6μlのFuGENE HDトランスフェクション試薬をDNAミックスに一滴ずつ加える。このミックスを室温で15分間インキュベートする。コンプレックスの形成の間に、 293T細胞をあらかじめ暖めておいた新しい培地に撒く。DNA-FuGENE^® HDコンプレックスを700μlの培地に希釈し、一滴ずつ細胞に加える。293細胞を24時間インキュベートした後、顕微鏡及びFACSで分析する。

結果と考察

293T細胞をFuGENE^® HDトランスフェクション試薬を使用して、anti-bcr/abl shRNAをコンストラクトとして含む第2世代のGFP（+） HIV-1派生レンチウイルスコンストラクトとパッケージングプラスミドがトランジェントにトランスフェクションしました。驚いたことに、位相差蛍光顕微 鏡による評価では、90%以上のトランスフェクション細胞が観察されました（図1）。トランスフェクションの48時間後、FACS分析では86.46%の eGFP陽性細胞が見られました（図2a）。また、細胞の生存活性もヨードプロピディウム染色で分析しました（図2b）。

結論

FuGENE^® HDトランスフェクション試薬を使用した、pLVTHM anti-bcr/abl shRNAプラスミドとパッケージングプラスミドでの293T細胞のトランスフェクションで、我々は素晴らしく改善されたトランスフェクション効率を得ま した。結論として、3種類のレンチウイルスプラスミドでトランスフェクションされた293T細胞の86.41%がeGFPを発現していました。FACSで のヨードプロピディウム染色は、レンチウイルスプラスミドとFuGENE^® HDトランスフェクション試薬では、わずかな細胞毒性効果しかないことを示しました。

リファレンス

1. Felgner PL, Ringold GM （1989） Nature 337:387-388
2. Dull T et al. （1998） Virol 72:8463-8467
3. Wiznerowicz M et al. （2006） Nat Methods 3 :682-688

図1：トランスフェクションされた293T細胞。

図2：FACS分析。
293T細胞がトランスフェクションの2日後に採取されました。（a） トランスフェクション効率は、トランスフェクションされていないK562細胞を陰性コントロールとして使用し、GFPの発現で評価されました。（b） 細胞毒性はヨードプロピディウム染色で分析されました。

BIOCHEMICA2007NUMBER3(No108)