がん研究を容易にするFuGENE® HDトランスフェクション試薬

Protein Expression コーナー

Susan Calvin, Simone Pitz, and Linda Jacobsen
Roche Applied Science, Indianapolis, USA; Roche Applied Science, Mannheim, Germany

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
FuGENE® HD トランスフェクション試薬	4 709 691 4 709 705 4 709 713	0.4 ml 1 ml 5×1 ml	←製品番号をクリック

がん研究のいくつかのエリアで最大の問題は、トランスフェクションという手法それ自身の細胞毒性とオフターゲット効果を最小限にしたうえで、多数の細胞 をトランスフェクションするのが困難なことです。いくつかのトランスフェクション試薬が生存細胞において、高レベルの遺伝子発現をもたらすことが良く知ら れています。しかしながら、これらはまた高レベルの細胞死や細胞変化をもたらすことも知られています。FuGENE^® HDトランスフェクション試薬はこれらの問題を克服し、多くのがん細胞を高いレベルでトランスフェクションし、今まで不可能だった実験を行うことが可能となりました。

多くの腫瘍細胞で新しいレベルのトランスフェクション効率

内部及び外部評価において、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬はがん研究で使用される多くの細胞株で、他の試薬には無い高い発現レベルでのトランスフェクションを成功させています（表1）。図1において、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬は細胞増殖阻害に最小限の影響しか持ちませんが、他の試薬（L2K）では様々な比率において円形の細胞、細胞数の減少、生存細胞における過剰な空包、染色前の培地中の細胞残渣などの、細胞毒性のシグナルが見られます。

表1：FuGENE^® HDトランスフェクション試薬でトランスフェクションが成功した細胞株リスト。完全な細胞株のリストを含む詳細は、www.powerful-transfection.comを訪問してください。

腫瘍の由来組織	生物種	トランスフェクションが成功した細胞株の数
神経/脳/グリア	ヒト/マウス/ラット	4/1/1
大腸/胃	ヒト	8
リンパ系/血液	ヒト/マウス	4/1
肝臓	ヒト	3
骨	ヒト	3
頭頸部	ヒト	2
乳腺	ヒト	2
皮膚（メラノーマ）	ヒト	2
膵臓	ヒト	2
卵巣	ヒト	2
線維性結合組織	ヒト	2
精巣	マウス	1
子宮	ヒト	1
絨毛膜/臍帯	ヒト	1
膀胱	ヒト	1
前立腺	ヒト	1
肺	ヒト	1
腎臓	ヒト	1

100%血清条件下での効率的なトランスフェクション

細胞応答はin vivoと、10%ウシ胎児血清やアミノ酸、ビタミン、ミネラルを含む環境下で増殖するin vitro細胞培養で、大きく異なります。FuGENE^® HDトランスフェクション試薬は、よりin vivoでの状況に近い100%血清存在下でも細胞をトランスフェクションします（図2）。ほぼ同様の発現レベルが、10%血清を含む標準培地中で腫瘍細胞をトランスフェクションした際に、見いだされました。

単一細胞の分析にも十分な穏和さ

単一細胞の分析をするためにトランスフェクションされた細胞を使用することは、トランスフェクション試薬に起因する高い細胞毒性や生存細胞でのオフターゲット効果により、過去には制限がありました。FuGENE^® HDを使用して、トランスフェクションコンプレックスのトータル量を減らすことで、低い細胞密度の腫瘍細胞をトランスフェクションしたことを示しました （図3）。細胞に加えるトランスフェクションコンプレックスの比率と量を至適化したとき、最少のオフターゲット効果で、細胞の増殖と発現が続きました。

正常細胞機能のかく乱を最小限にしつつ高い発現レベルを達成

すべてのトランスフェクション技術は様々なレベルで細胞毒性とオフターゲット効果を誘導し、対象遺伝子の細胞応答を隠したり変化させます。
適切な実験的コントロールが無い場合（空ベクターのトランスフェクションなど）、トランスフェクションされた遺伝子に起因する効果と、トランスフェクションそれ自身に起因する効果を誤って評価するかもしれません。我々は以前に、FuGENE^® 6、FuGENE^® HD、L2K試薬を使用して空ベクターとレポータージーンを含むベクターをトランスフェクションした際の、亢進及び抑制された転写産物の分析を行いました ［1-3］。これらの実験データを分析する中で、どれくらいの転写産物がレポータージーンタンパク質の産生に関与したか、あるいはSEAP発現で特異的に 亢進及び抑制されたかを評価しました（表2）。

この分析で明瞭となったことは、2種類のトランスフェクション試薬により影響された転写産物の数が大きく異なることです。FuGENE^® HDトランスフェクションを用いたとき、空ベクターは197遺伝子の亢進及び抑制を引き起こし、そのうちの56遺伝子はSEAP遺伝子を含むベクターのトランスフェクションによっては影響されませんでした。

変化したすべての転写産物のうち、21個のみがSEAPタンパク質が発現したときに特徴的に変化しました。同じ分析をHeLa細胞で行ったときは、両方 の試薬でSEAPベクターの影響は67個の転写産物のみでした（データ未掲載）。多数のコントロールを使用することですべての転写産物を注意深く分析しな い場合、対象遺伝子の発現の結果なのか、トランスフェクションという行為の結果なのかを正確かつ確実に主張することは困難です。

表2に見られるように、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬はL2K試薬に比べ、非特異的な影響を最小限にしています。それに加え、SEAPタンパク質の総発現はより高くなっています（データ未掲載）。

 

表2：FuGENE^® HDトランスフェクション試薬とL2Kでトランスフェクションした後にMCF7細胞で差異的に発現した遺伝子。MCF7（ATCC^® HBT-22™）をSEAP発現シークェンスを持つ/持たないベクターでトランスフェクションしました。トランスフェクションの2日後に、トランスフェク ション細胞と未トランスフェクション細胞のmRNAレベルを比較しました。繰り返し実験からのデータも同様でした（データ未掲載）。

	FuGENE® HD トランスフェクション試薬	L2K試薬
空ベクター（SEAPのシークェンスを持たない）でトランスフェクションしたときに亢進及び抑制された転写産物の数	197	1,405
SEAPのシークェンスを持ったベクターでトランスフェクションしたときに亢進及び抑制された転写産物の数	282	1,741
両方のベクターで亢進及び抑制された転写産物の数	141	1,173

結論

他の市販のトランスフェクション試薬と比べたとき、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬はがん研究に有用な多くの利点を示します。これは低毒性と最小限のオフターゲット効果を持ちながら、多くの腫瘍細胞タイプ を、様々な細胞密度や血清レベルで効率的にトランスフェクションします。これらの特長は、より明瞭な実験結果と新たな実験価値をもたらします。

リファレンス

1. Nagy V, Watzele M （2004） Biochemica 4:9-11
2. Calvin S et al. （2006） Biochemica 4:22-25
3. Wang J （2006） Genetic Engineering News 26:22-27

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関連製品名	製品番号	包装単位	希望価格
SEAPレポータージーンアッセイ、化学発光	1 779 842	1キット	←製品番号をクリック

図1：FuGENE^® HDトランスフェクション試薬とその他の市販のトランスフェクション試薬（L2K）を使用してのβ-ガラクトシダーゼの発現。
MCF7（ATCC^® HBT-22™）とHepG2（ATCC^® HB-8065™）細胞をLacZを含むプラスミドで、両試薬のプロトコールに従いトランスフェクションしました。数種類の試薬：DNA比を試験し、発現はβ-ガラクトシダーゼの染色で測定しました。各試薬の最良の結果は、5：2（FuGENE^® HDでは2.5μlの試薬：1μgのDNA、L2Kでは5μlの試薬：2μgのDNA）の比率で見られましたが、L2Kは細胞毒性の形態学的な証拠が容易に観察されました。同じ比率のFuGENE^® HDでは素晴らしいトランスフェクション効率でしたが、可視による細胞毒性効果は見られませんでした。

図2：100％ FBS存在下での腫瘍細胞のトランスフェクション。
正常な条件化で培養を維持しているヒト腫瘍細胞から標準的な培地を除去し、100% FBSに置き換えました。1時間後に、FuGENE^® HDを使用してLacZを含むプラスミドで細胞をトランスフェクションしました。コンプレックスを100%血清中の細胞に直接加えました。48-72時間 後に、遺伝子の発現をβ-ガラクトシダーゼの染色で測定しました。使用したプロトコールや他の腫瘍細胞でのデータを含む更なる詳細は、www.powerful-transfection.comを訪問してください。

図3：低密度のHeLa細胞でのグリーンフルオレッセントタンパク質の発現。
HeLa（ATCC^® CCL-2™）細胞を低密度（96ウェルプレートのウェル当り3,000個）で播種し、様々な量と比率の試薬：DNAコンプレックスでトランスフェクショ ンしました。高GFP発現結果をもたらしたいくつかの条件；少量のコンプレックス（1μl）を加えたときには、トランスフェクションの48時間後には細胞 毒性の形態学的証拠は見られませんでした。1μl-3μlのコンプレックスの添加は高い発現と低毒性を示しました。5μlの添加は細胞毒性がありました （データ未掲載）。写真は3：2（0.03μlの試薬と0.02μgのDNA）の比率、1μlでのトランスフェクション細胞を示しています。

BIOCHEMICA2007NUMBER2(No107)