FuGENE® HDトランスフェクション試薬を使用したニューロブラストーマ細胞株のトランスフェクション

Gene Expression コーナー

Volker Spitzenberg and Michael Grün
Institute of Molecular Cell Biology, Medical Faculty of the University of Jena, Germany

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
FuGENE® HD トランスフェクション試薬	4 709 691 4 709 705 4 709 713	0.4 ml 1 ml 5×1 ml	製品番号をクリック 製品番号をクリック 製品番号をクリック

細胞の効果的なトランスフェクションは、遺伝子操作に欠くことが出来ません。しかしながら、多くの細胞株はトランスフェクションがいまだ困難で、それに 続く分析を妨げます。ここで、我々はニューロブラストーマ細胞株のトランスフェクションでの、3種類の異なる方法（FuGENE^® HDトランスフェクション試薬、トランスフェクション試薬L、リン酸カルシウム法）を比較しました。FuGENE^® HDは、更なる分析のために高い効率でこれらの細胞をトランスフェクションできることが示されました。

イントロダクション

細胞研究では常に、遺伝子操作の研究において細胞のトランスフェクションが必要とされます（研究対象の遺伝子の過剰発現やノックダウンなど）。 HEK293やHeLa細胞のトランスフェクションで良好に作動する、多くの様々なトランスフェクション法が現在では入手できますが、標準的なプロトコー ルではトランスフェクションが難しい多くの細胞タイプが存在しています。ニューロブラストーマ細胞株であるSK-N-AS、SK-N-LO、SK-N- MCはこれらの細胞タイプに属し、リン酸カルシウム法やトランスフェクション試薬L、DEAEデキストランなどの試薬によるトランスフェクションに抵抗し ています（図1及び未掲載データ）。効率的なトランスフェクションを達成する試みにおいて、我々はこれらの細胞株をトランスフェクションする能力におい て、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬、トランスフェクション試薬L、リン酸カルシウム法に基づくトランスフェクションのキットを比較しました。トランジェントに トランスフェクションされた細胞を定量化するためにEGFPレポーターコンストラクトとFACS分析を使用して、我々はFuGENE^® HDを使用したときに、3種類の細胞株で素晴らしいトランスフェクション能（24%のEGFP陽性細胞レベルまで）を見出しました。

表1：様々な方法によるニューロブラストーマのトランスフェクション

トランスフェクション法	EGFP陽性細胞（％）
	SK-N-AS	SK-N-LO	SK-N-MC
トランスフェクション試薬L	2	<1	2
リン酸カルシウム	<1	24	測定せず
FuGENE® HDトランスフェクション試薬4：2	24	19	7
FuGENE® HDトランスフェクション試薬6：2	15	12	4
FuGENE® HDトランスフェクション試薬8：2	20	12	3

材料と方法

トランスフェクション

トランスフェクションの前日に、24時間以内に60%のコンフルエンシーとなるように、350,000個の細胞（SK-N-MC、SK-N-LO）と 500,000個の細胞（SK-N-AS）を6ウェルプレートに播種しました。細胞をトランスフェクション試薬L、リン酸カルシウム法に基づく哺乳細胞ト ランスフェクションキット、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬を用いて、各メーカーのプロトコールに従いpHygEFGP（Clonetech, USA）でトランスフェクションしました。

FuGENE^® HDの場合は、トランスフェクションの前に培地を新しくしました。2μgのベクターを含むDNA溶液を100μlになるように、Optimemで希釈しました。（プロトコールに推奨されている）4：2、6：2、8：2の比率となるように、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬（4μl、6μl、8μl）を加えました。ミクスチャーを室温で15分間インキュベートし、その後に細胞に加えました。至適な増殖条件下で5時間インキュベートした後、増殖培地を新しいものに交換しました。

トランスジーン発現の分析

トランスフェクションの2日後に細胞を採取し、生細胞と死細胞を分別するためにヨードプロピディウム（PI）で染色し、EFGP発現は FACSCalibur（Becton-Dickinson, USA）で測定しました。データの集積はCell Quest Pro（Becton-Dickinson）とWinMDIソフトウェア（J. Trotter, The Scripps Research Institute）を使用して行いました。

結果と考察

pHygEFGPベクターとFuGENE^® HDトランスフェクション試薬を使用して、ニューロブラストーマ細胞株のSK-N-AS、SK-N-LO、SK-N-MCで素晴らしいトランスフェクショ ン効率が得られました。トランスフェクションの2日後のFACS分析は、サンプル当り24%のEFGP陽性細胞を実現しました（図1と表1）。それに対し て、トランスフェクション試薬Lは3種類の細胞株で、言及できるほどのEFGP陽性細胞は得られませんでした（最大2%）。リン酸カルシウム法は、SK- N-LOでは後の分析に使用できる程度に十分にトランスフェクションできました（24％陽性細胞、表1）が、SK-N-ASでは効率的ではありませんでし た。顕微鏡（データ不掲載）および、採取細胞のPI染色（図1）で見る限り、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬は、それぞれの使用濃度で毒性を示しませんでした。3種類の細胞株で、FuGENE^® HD試薬：DNA比を減らした場合にトランスフェクション細胞の数が増加する傾向を示しました。しかしながら、この効果が顕著かどうか、更に比率を減らし た場合でより高い効率が得られるときに、明言されるべきでしょう。細胞当りのEFGP発現レベル（FACS分析）では、異なる試薬：DNA比の影響は見ら れませんでした（図1と未掲載データ）。

結論

EFGPレポータージーンを使用して、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬は試験された3種類のニューロブラストーマ細胞株で、満足すべきトランスフェクション能力を見せました。これは他の2種類の方法より優れていました。それゆえ、FuGENE^® HDトランスフェクション試薬は、他の方法では困難な神経細胞の遺伝子操作に最適でしょう。現在進行中の実験で、我々は、FuGENE^® HDでトランスフェクションしハイグロマイシンとG418でセレクションしたステーブルトランスフェクションのクローンを得ています。これらのクローンは安定した完全性とタンパク質発現レベルのために更に評価中です。

近い将来での役目は、我々の実験結果を保証するために、他のトランスフェクションが困難な細胞（初代神経細胞）でも同一の結果が得られるかテストすることです。

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関連製品名	製品番号	包装単位	希望価格
ハイグロマイシンB	843 555	1 g	製品番号をクリック
ジェネティシン（G418）溶液	4 727 878 4 727 894	20 ml 100 ml	製品番号をクリック 製品番号をクリック

図1：SK-N-AS細胞のトランスフェクション。
SK-N-AS細胞はトランスフェクション試薬L、リン酸カルシウム法、3濃度のFuGENE^® HDトランスフェクション試薬で、pHygEGFPがトランスフェクションされました。トランスフェクションの2日後に、細胞を採取し、PIで染色し、FACSで分析しました。

BIOCHEMICA2007NUMBER1(No106)