コンプリートライシスキット：プロテアーゼからタンパク質を保護しつつ抽出を迅速に

Protein Expression コーナー

Cordula Nemetz, Claudia Vorwerk, and Claudia Kirr
Roche applied Science, Penzberg Germany

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
コンプリート ライシス-B（2×）	4719930	100 ml＋20錠	←製品番号をクリック
コンプリート ライシス-B、EDTAフリー	4719948	100 ml＋20錠	←製品番号をクリック
コンプリート ライシス-M	4719956	200 ml＋20錠	←製品番号をクリック
コンプリート ライシス-M、EDTAフリー	4719964	200 ml＋20錠	←製品番号をクリック
コンプリート ライシス-Y	4719972	200 ml＋20錠	←製品番号をクリック
コンプリート ライシス-Y、EDTAフリー	4719999	200 ml＋20錠	←製品番号をクリック

利点

• 哺乳細胞やバクテリア、酵母の簡便、迅速、穏やかな溶解用のレディー・ツー・ユースの試薬により時間が節約できます
• 高収量の 抽出タンパク質が得られます
• タンパク質の変性や影響を及ぼさない試薬を使用することで、タンパク質の完全性を保証します
• 複数のプロテアーゼ（セリン、システイン、メタロプロテアーゼ）からの、無毒性で効率的なタンパク質保護を達成しました
• ダウンストリームのアッセイに影響しない試薬を採用しています

イントロダクション

試料の調製はタンパク質分析の三大主要分野、発現プロテオミクス、構造プロテオミクス、機能プロテオミクスで必須のステップです。機械的、化学的、酵素 的方法はタンパク質の活性や完全性に直接干渉するため、細胞から効率的にタンパク質を抽出する穏やかな方法が必須となっています。細胞を溶解するためのマ イルドな界面活性剤の使用は、他の一般的に使用される厳しい処理に比べ、シンプルで、効果的、しかも簡便な方法ですレディー・ツー・ユースのコンプリート ライシスリェージェントは短時間での溶解を可能にするため、超音波破砕などの従来法と比べ、並行して多数のサンプル処理（マイクロタイタープレート中）が 出来ます。溶解試薬とコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠を組み合わせることで、多数のプロテアーゼを細胞溶解時に阻害できます。これは、効 率的なタンパク質分析の成功に必要な標準化と信頼性の高いレベルを保証します。コンプリートライシス-B（2×）とM、Yは効率的で穏やかな溶解試薬とコ ンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠を含んでいます。キットはまたEDTA-フリーのタイプも入手できます。

迅速かつ効率的なバクテリア細胞の溶解と共同して作用するプロテアーゼ阻害

コンプリートライシス-Bキット内のライシス-Bリェージェントは2倍濃度のタンパク質抽出試薬でより少量での細胞溶解を可能にします。これはレ ディー・ツー・ユースの溶液で、更なる希釈は不要です。バクテリア細胞と昆虫細胞を効率的活穏やかに溶解できる非イオン系の界面活性剤より構成されていま す。
このキットがE. coli BL21 DE3 pLYsSバクテリア細胞で過剰発現されたGFPの抽出に用いられました。細胞をOD₆₀₀が 1.5－2.0のときに遠心で採取し、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠を含むライシス-B試薬（1錠/5 ml溶解試薬）中に再懸濁しました。図1は全分画、上澄分画、ペレットのクマシーブルー染色によるSDS-ゲル分析を示しています。典型的に、ブラッド フォードプロテインアッセイにより、3－4 mg/mlのタンパク質がE. coli BL21細胞から得られました（図1b）。プロテインアッセイのスタンダードカーブはウシ血清アルブミンを、1：5に水で希釈したライシス-B試薬に溶解しました。同時に、タンパク質収量の測定のために、前もってバクテリアタンパク質の全抽出液を1：5に希釈しました。

効率的な真核細胞の溶解と共同して作用するプロテアーゼ阻害

ライシス-Mやライシス-Y試薬の界面活性剤に組み合わせは、培養接着哺乳細胞や浮遊哺乳細胞（ライシス-M）、多くの酵母株やバクテリア細胞[Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Bacillus subtilis, E. coli, 幅広い種のグラム陰性細菌（ライシス-Y試薬）]の効率的なタンパク質抽出を可能にします。

ライシス-Mレディー・ツー・ユース溶液はCos-7モンキー腎臓細胞の溶解に、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠と組み合わせて使用さ れました。細胞をコンフルエントのときに採取し、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠（1錠/10 ml溶解試薬）を含むライシス-M試薬中に再懸濁しました。図2において、全タンパク質、上澄、ペレット分画の典型的なSDS-PAGE分析が示されてい ます。全タンパク質の収量は、ブラッドフォードプロテインアッセイで測定しました。すべての細胞抽出液はアッセイの前に水で5倍希釈しました。コンフルエ ントなCos-7、Jurkat細胞と酵母（S. cerevisiae）からのタンパク質収量は図2bに示しました。

コンプリートライシスキットやプロテアーゼインヒビターの詳細は：www.roche-applied-science.com/proteaseinhibitorを訪問してください。

図1：原核細胞の溶解。 (a)E. coliから抽出したタンパク質のSDS-PAGE分析。BL21 DE pLysS細胞を採取し、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠を含む溶解試薬中に再懸濁しました。抽出したタンパク質はSDS-PAGEとク マシーブルー染色により分析しました（5μg/レーン）。M =マーカー；W =全分画；S =上澄；P =ペレット分画。(b)ライシス-B試薬の溶解効率。BL21細胞をマニュアルに従いライシス-B試薬内に採取しました。全タンパク質分画の収量はそれぞ れ別の溶解反応で各3回、ブラッドフォードプロテインアッセイ（50μlのタンパク質抽出液 + 2.5 mlブラッドフォード試薬）で測定しました。

図2：真核細胞の溶解。 (a)真核細胞から抽出したタンパク質のSDS-PAGE分析。コンフルエントなCos-7細胞をライシス-M試薬中に採取しました。抽出したタンパク質 をSDS-PAGE（10μlサンプル/レーン）で分析しました。M =マーカー；レーン1 =全分画；レーン2 =上澄；レーン3 =ペレット分画。(b) ライシス-Mと-Y試薬の溶解効率。コンフルエントなCos-7細胞とJurkat細胞をマニュアルに従いライシス-M試薬内に採取しました。130 mgのSaccharomyces cerevisiae細胞ペレットは500μlのライシス-Y試薬に再懸濁しました。全タンパク質分画の収量は水で1：5に希釈した後、それぞれ別の溶解 反応で各2回、ブラッドフォードプロテインアッセイ（50μlのタンパク質抽出液 + 2.5 mlブラッドフォード試薬）で測定しました。

BIOCHEMICA2006NUMBER3(No104)