DNaseI Recombinant, RNase-free： 厳しい要求のための高品質なツール

Gene Expression コーナー

Cordula Nmetz* and Claudia Vorwerk
Roche Applied Science, Penzberg, Germany
*Corresponding author: cordula nemetz@roche.com

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
DNase I recombinant, RNase-free	4716728	10,000ユニット （10U/μl）	←製品番号をクリック

イントロダクション

DNAフリーのRNAを調製する事は、RT-PCR前の重要なステップです。様々なサンプルから抽出したトータルRNAには、DNAが混入している可能 性があり、そのDNAは増幅反応でRNAターゲットからの増幅に似た増幅をしてしまいます。DNase I Recombinant, RNase-freeは、RNAサンプルから、安全かつ効率的にDNAを除去します。

コンタミネーションしたDNAの完全な除去

DNase I Recombinant, RNase-freeの容量活性は10×10³ U/mlです。新製品DNase I recombinant, RNase-freeの分解効率は、LightCycler^®を用いてSYBR Greenとβグロブリン特異的プライマーを用いて定量されました。

このために、βグロブリン遺伝子は100ngのヒトゲノムDNA（LightCycler^® Control Kit DNA）をテンプレートにして増幅されました。一方は1ユニットのDNase I recombinant, RNase-freeで事前に処理したDNAを、もう一方はDNase Iで処理していないDNAを使用しました。両反応のクロッシングポイント値を分析し、スタンダード希釈系列から得られた値と比較しました（データ未掲 載）。

図1は、DNase I recombinant, RNase-free処理をしていないサンプルのクロッシングポイント値20.15から、DNase I recombinant, RNase-free処理したサンプルの値40.64にシフトした事を示し、これはゲノムDNAの1μgに相当します。リアルタイムPCRシグナルのこの 大きいシフトは、検出限界における混入DNAの効率的で優れた分解を示しています。

RT-PCRの前のゲノムDNAの分解

RT-PCRによるRNA転写の検出のためには、RNAサンプルからのゲノムDNAの除去は必須条件です。RT-PCRのために、ヒト肝癌細胞 HepG2細胞からRNAを調製した後、DNase I recombinant, RNase-freeで残余のDNAを消化します。そのために、RNAを少量のDNase I recombinant, RNase-freeとインキュベーションした後に、加熱不活性化ステップを行います。

図2は、ヒトβアクチン特異的プライマーでRT-PCRした後のアガロースゲル分析を示しています。特異的な587 bpのシングルバンドは、ネイティブとリコンビナントのDNase I, RNase-freeで処理した産物に見られます。DNase I で処理していない産物はゲノムDNA由来の非特異的バンドが検出されました。

他の実験として、DNase I recombinant, RNase-freeはリアルタイムRT-PCRで検証されています。上述のDNase I で処理した後、逆転写反応とLightCycler^® h-ALAS Housekeeping Gene Setを用いたリアルタイムPCRを行いました。図3のように、DNase I recombinant, RNase-freeで処理されたRNAサンプルは早期に陽性シグナルを示し、RNAの完全性を表しています。

信頼できるリコンビナント酵素

最小レベルのコンタミネーションのリコンビナントの動物成分フリーの酵素は信頼できます。再現性のある結果を確かめているロット間の一貫性は信頼できます。

この高く精製された酵素は、ネイティブのウシ由来酵素の性能を上回り、より低いRNaseとプロテアーゼ活性であり、DNAは含まれません。

この酵素は10U/μlの便利な溶液タイプです。専用の10×反応バッファーが添付されています。

図1：DNase I, RNase-free処理と未処理のゲノムDNAからのβグロビンの増幅

図2：βアクチン特異的プライマーを使用したRT-PCR実験 RNAは、HepG2細胞からHigh Pure RNA Isolation Kitを用いてカラム上のDNase I 処理を行わずに抽出されました。溶出産物の20μlを、4UのDNase I, RNase-free処理、4UのDNase I recombinant, RNase-free処理、DNase I 未処理としました。そのRNAの5μlをTranscriptor Reverse Transcriptaseとランダムヘキサマーを用いて20μlの容量で逆転写反応を行いました。βアクチン遺伝子を5μlのcDNAからブロックサイ クラーを用いて増幅しました。

図3：LightCycler® h-ALAS Housekeeping Gene Setを用いたリアルタイムRT-PCR実験 RNAは、HepG2細胞からHigh Pure RNA Isolation Kitを用いてカラム上のDNase I 処理を行わずに抽出されました。溶出産物の20μlを、DNase I 未処理、あるいは4UのロシュのDNase I , RNase-free、4UのロシュのDNase I recombinant, RNase-free、4Uのサプライヤー I と II のDNase I recombinant, RNase-freeで37℃、10分間インキュベーションした後、75℃で10分間加熱して不活性化しました。そのRNAの5μlを Transcriptor Reverse Transcriptaseとランダムヘキサマーを用いて20μlの容量で逆転写反応を行いました。続いて、h-ALAS特異的プライマーと HybProbeを用いてリアルタイムPCRを行いました。

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
LightCycler® h-ALAS Housekeeping Gene Set	3302504	1セット （96反応）	←製品番号をクリック
LightCycler® DX400	3531414	1台	ご照会下さい
LightCycler® Control Kit DNA	2158833	1キット （50反応）	←製品番号をクリック
Transcriptor Reverse Transcriptase	3531317 3531295 3531287	250ユニット （25反応） 500ユニット （50反応） 2,000ユニット （200反応）	←製品番号をクリック ←製品番号をクリック ←製品番号をクリック
High Pure RNA Isolation Kit	1828665	1キット （50反応）	←製品番号をクリック

BIOCHEMICA2006NUMBER2(No103)