FastStart PCR Masterを用いたダイレクトコロニーPCRによる迅速スクリーニング

Gene Expression コーナー

Sibel Deniz, Isabel Franke, Manfred Schmidt, Harald Sobek, and Oliver Seth^*
Roche Applied Science, Penzberg, Germany
^*Corresponding author: Oliver.Seth@roche.com

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
FastStart PCR Master	4710436 4710444 4710452	100回反応 400回反応 2000回反応	←製品番号をクリック ←製品番号をクリック ←製品番号をクリック

イントロダクション

FastStart PCR MasterはダイレクトコロニーPCRにおいて、非常に使い易く理想的なツールです。 事前のテンプレート調製は不要で、完全なバクテリアの状態のまま直 接分析できます。 そのため、FastStart PCR Masterはクローニング実験における迅速スクリーニングに最適です。
ここでは、ダイレクトコロニースクリーニングを含むmRNAのクローニングと増幅のためのFastStart PCR Masterの使用方法を説明します。 実験の概略は図1に示します。

図1：実験方法 ロシュ・アプライド・サイエンスのFastStart PCR Masterは、手早く使い易いready-to-useの2×濃度のマスターミックスです。 ブロック型サーマルサイクラーでのホットスタートPCRに必 要な全ての試薬（FastStart Taq DNA Polymerase、塩化マグネシウム、2倍濃度の反応バッファー、安定化剤、ヌクレオチドミックス）が予めミックスされています（プライマーとテンプ レートは除く）。 ホットスタートPCRプロトコールはPCRに高い特異性と高い感度、さらに高い収量をもたらします。

材料と方法

High Pure RNA Isolation Kitを用いて、K562細胞からトータルRNAを抽出しました。得られたRNAは、Transcriptor Reverse TranscriptaseでcDNAに逆転写しました。このcDNA合成はTranscriptor Reverse Transcriptaseの製品説明書に従い、ランダムヘキサマープライマーと一般的なサーマルサイクラーを用いた2ステップRT-PCRで行いまし た。

次のcDNAの増幅ステップでは、Pwo SuperYield DNA Polymeraseと比較しながらFastStart PCR Master Mixを使用しました。 Pwo SuperYield DNA Polymerase（使い易いマスターミックス製品としてPwo Master があります）は、プルーフリーディング活性のあるポリメラーゼで、 FastStart PCR MasterやFastStart Taq DNA Polymeraseに比べて18倍の高い正確性を示します。

増幅ターゲットは、ヒト インターロイキン遺伝子（IL-2）の380 bp断片です。 プライマーには遺伝子特異的プライマー（5'CTCACCAGGATGCTCAC、3'GTAGCAAACCATACATT）を使用しまし た。 増幅反応は各ポリメラーゼの製品説明書に従って行いました。温度サイクルは次のとおりです。

1サイクル	94℃	2分
35サイクル	94℃	30秒
	55℃	30秒
	68℃	45秒
（25サイクルより各ステップで5秒ずつ追加していく）
1サイクル	68℃	7分

　

各反応産物は1% アガロースゲル（アガロースMP）で電気泳動し、 1 µg/mlエチジウムブロマイドで染色し、DNA分子量マーカーⅧと比べてPCRの可否を検定しまし た。 PCR産物はHigh Pure PCR Product Purification Kitで精製しました。次に、FastStart PCR Masterで合成したPCR産物をT4 DNA Polymeraseでポリッシュして平滑末端のPCR断片を合成しました。 1 UのT4 DNA Polymeraseと300 ngのPCR産物、反応バッファー、dNTPsを37℃で30分間インキュベートしました。 続いて、ポリッシュしたPCR断片をHigh Pure PCR Product Purification Kitで精製しました。

Pwo SuperYield DNA Polymearaseはターミナルトランスフェラーゼ活性を示さず、平滑末端PCR断片を合成します。 そのため、Pwo SuperYield DNA Polymearaseの増幅断片では、ポリッシングは必要ありません。

各増幅産物は、PCR Cloning Kit（Blunt-end）を用いてpCAPsクローンベクターにクローニングしました。 ベクターの制限酵素処理、ライゲーション、コントロール実験は 製品説明書に従いました。 2種類のポリメラーゼで増幅したPCR産物の各ライゲーション反応産物を、 PCR Cloning Kit (Blunt-end)の製品説明書に従ってコンピテントE. coli DH5αに組み替えました。 様々な量（50～100µl）の組み換えE. coli を 100µg/mlのアンピシリンを含むLB選択培地に播種し、プレートを37℃で16～18時間インキュベートしました。 次に、それぞれのプレートから ランダムに10コロニーを選び、爪楊枝で50µlの水に取り、95℃で5分間加熱しました。 13000 rpmで1分間遠心し、その上清をダイレクトコロニーPCRに用い、遺伝子特異的プライマーとFastStart PCR Masterを用いて、ポジティブコロニーの同定を行いました。 PCR温度サイクルは下記のとおりです。

1サイクル	94℃	2分
10サイクル	94℃	30秒
	55℃	30秒
	68℃	45秒
20サイクル	94℃	30秒
	55℃	30秒
	68℃	45秒
（各ステップで5秒ずつ追加していく）
1サイクル	68℃	7分

cDNA増幅はアガロースゲル電気泳動で解析しました（図2）。

図2：性能比較 FastStart PCR Master（FS）とPwo SuperYield DNA Polymerase（PWO）をそれぞれの製品説明書どおりに用いて増幅しました。FastStart PCR MasterのPCR効率はPwo SuperYield DNA Polymeraseと同程度のものでした。

結果と考察

テンプレート増幅の為のPCR

アゲロースゲル電気泳動の結果は、各 ポリメラーゼが380bp断片を増幅した事を示しています（図2）。FastStart PCR MasterとPwo SuperYield DNA Polymeraseは同程度のPCR産物収量を示しました。

コロニースクリーニングの為のPCR

コロニー数を数えたところ、各クローニング実験において50コロニー以上が得られました。

FastStart PCR MasterはダイレクトコロニーPCRに使用され、ランダムに選択した20コロニーの全てにおいて、 380 bp断片がライゲーションされたプラスミドベクターpCAPsの導入が認められました（図3、4）。 よって、本クローニング実験は、テンプレート増幅に用 いたPCRシステムに左右されず成功したことを示しています。 FastStart PCR Masterは特にE. coli 細胞のダイレクトPCRに最適です。 また、FastStat PCR MasterとPwo SuperYield DNA Polymeraseの両増幅産物は、後のクローニングに非常に適しています。

使い易いready-to-useのFastStart PCR Master は、ホットスタートPCRにおいて理想的なツールです。 さらに、ダイレクトコロニーPCRで利点を示します。FastStart PCR Masterは、1バイアルの試薬で簡単にハイスループットスクリーニングが可能です。 コロニーPCRは、クローニングに成功したインサートの検出を簡素 化するための手法です。 効率的なワークフローを可能にし、これまでの煩雑な時間のかかる分析に置き換えられます。

図3：pCAPs組み換えDH5αのコロニースクリーニング FastStart PCR Masterを用いたコロニーPCRで、IL-2遺伝子の380bases断片の増幅を行いました。cDNA 増幅はFastStart PCR Masterを用いました。これはランダムに選択したコロニーがライゲーション産物を含んでいる事の証拠です。

図4：pCAPs組み換えDH5αのコロニースクリーニング FastStart PCR Masterを用いたコロニーPCRで、IL-2遺伝子の380bases断片の増幅を行いました。cDNA 増幅はPwo SuperYield DNA Polymeraseを用いました。これはランダムに選択したコロニーがライゲーション産物を含んでいる事の証拠です。

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
Pwo SuperYield DNA Polymerase	4340868 4340850	100ユニット 2×250ユニット	←製品番号をクリック ←製品番号をクリック
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	4379012	50回反応	←製品番号をクリック
High Pure PCR Product Purification Kit	1732668 1732676	50 回精製 250 回精製	←製品番号をクリック ←製品番号をクリック
High Pure RNA Isolation Kit	1828665	50 回抽出	←製品番号をクリック
PCR Cloning Kit	1939645	1キット	←製品番号をクリック
T4 DNA Polymerase	1004786 1004794	100ユニット 500ユニット	←製品番号をクリック ←製品番号をクリック
DNA Molecular Weight MarkerⅧ	1336045	50µg	←製品番号をクリック
Agarose MP	1388983 1388991	100 g 500 g	←製品番号をクリック ←製品番号をクリック
Ampicillin	835242 835269	5 g 50 g	←製品番号をクリック ←製品番号をクリック

結論

この結果は、新製品FastStart PCR Masterが非常に実用性と信頼性、汎用性の高いホットスタートPCRツールであることを示しています。FastStart PCR Masterは迅速で使い易い理想的なホットスタートPCRツールです。

BIOCHEMICA2006 NUMBER1 (No102)