NEW: MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue):哺乳動物組織からのトータルRNAの自動分離精製

Gene Expression コーナー

Agnes Aschenbrenner, Irene Huber, Elke Holzner, Werner Malmberg, Klaus Geibler, Nera Nieswandt, Walter Eberle, and Thomas Kirschbaum*

Roche Applied Science, Penzberg, Germany

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MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue)	4643542	32回 分離精製用	←製品番号をクリック

イントロダクション

MagNA Pure Compactシステム用に新しく開発したMagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue)は、10 mgまでの哺乳動物組織から高純度なトータルRNAを分離精製できます。分離精製されたトータルRNAは、遺伝子発現の研究におけるライトサイクラーある いは他のPCR装置による高感度な定量的RT-PCR解析や、アレイのアプリケーションに適しています。このReady-to-useのキットには、充填 済み試薬カートリッジやDNase、組織溶解バッファー、そして必要となる消耗品がすべて揃っています。核酸分離精製の全工程はMagNA Pure Compact装置において全自動で遂行されます。

この新しいキットの試薬とプロトコールは哺乳動物組織からRNAを高収量で得られるよう最適化されています。8サンプルまでの抽出であれば、約38分で終了します。溶出容量は50 μlまたは100 μlに設定できます。

ここでは、マウスあるいはヒト組織（表1）についてキットのテストを行い、RNAの完全性、収量、純度、再現性、スケーラビリティー、クロスコンタミネーション、溶出液の安定性、他の手法と比較したパフォーマンスに関して評価しました。

 

表1: 種々のサンプル材料からのRNA収量。RNAは材料と方法で記述されているように10 mgの組織から分離精製され、解析されました（CV、変動係数）。

サンプル材料	RNAの収量 （μg）	純度 （OD260 nm/ OD280 nm）	CV値 (%)	CV RT-PCR (%)	複製の数
マウス肝臓	42.2	1.99	9.1	1.1	24
マウス脾臓	57.5	1.97	8.7	1.4	8
マウス肺	11.6	2.03	14.9	2.3	8
マウス心臓	9.2	1.97	13.7	1.2	8
ヒト胎盤	12.7	2.10	3.8	1.1	8
ヒト大腸	14.9	2.05	10.3	0.9	8 定量

材料と方法

組織サンプル

組織サンプルのライセート（溶解産物）は、新鮮凍結切片に組織溶解バッファーを加え、MagNA Lyser装置で破砕して調製しました。1回の分離精製につき、10 mgまでのホモジナイズした組織ライセートを一定の液量350 μlで使用しました。組織ライセートは、多目のサンプル材料量からも調製し、適切に希釈した後、－70℃で最大3ヶ月保存しました。

MagNA Pure Compact装置によるRNA分離精製

MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue) の試薬カートリッジをバーコードリーダーで読み取り、カートリッジラックに差し込みます。チップトレイ、DNaseチューブ、組織ライセートの入ったサン プルチューブを、それぞれのラックポジションに置きます。スキャンを終えたバーコード付溶出チューブを溶出チューブラックに置きます。その後、200 μlの磁性ガラス粒子（MGP）懸濁液を加えます。ソフトウェアからプロトコールと溶出容量を選択し、自動分離精製工程をスタートしました。MagNA Pure Compact装置は総ての分離精製ステップ（プロテナーゼKによるタンパク質分解、サンプル中の核酸の結合、DNaseによるDNA分解、洗浄ステッ プ、精製されたRNAの溶出）を自動的に実行します。溶出液は－70℃で少なくとも6ヶ月は保存可能です。

精製RNAの解析

精製されたRNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzerあるいはアガロースゲル電気泳動で確認しました。収量は260 nmでの光学密度（OD）測定より計算し、純度はOD_260nm/OD_280nm比 で評価しました。精製RNAはライトサイクラーによる逆転写(RT)-PCRにも使用し、シクロフィリンA（CycA）とグルコース6リン酸脱水素酵素 （G6PDH）の転写産物の検出を行いました。溶出液中のDNA混入は、RTステップを除いたライトサイクラーによるcycA遺伝子特異的PCRを行うこ とで評価しました。

結果と考察

RNAの完全性

10 mgのヒト胎盤から分離精製されたRNAにおいて、完全長のrRNAのバンドが確認され、核酸の分解が無いことが示されました（図1）。

図1: RNAの完全性とアッセイの再現性。 RNAは10 mgのヒト胎盤から分離精製されました; 1 μlの各溶出液を、Agilent 2100 Bioanalyser を使用しRNA 6000 Nano Chipで解析しました（M, Ambion RNA 6000ラダー）。

再現性

MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue)によるヒト胎盤（図1）あるいは他の哺乳動物細胞(データ不掲載)からのRNAの分離精製は、優れた再現性を示しました。ここでテストさ れた総てのサンプルにおいて、収量の変動係数（CV）は15 ％以下、ライトサイクラーでのRT-PCRで得られたクロッシングポイント（CP）のCVは3 ％以下でした（表1）。

収量と純度

10 mgのマウス肝臓あるいは脾臓から、最大50 μgのRNA（OD_260nm測定より解析）が回収されました。RNA収量 は組織のタイプで大きく異なりました。例えば、10 mgのヒト胎盤の収量では、12 μg前後でした（表1）。更に、分離精製されたRNAの収量と品質は、サンプルの保存や組織の発現状況に大きく依存しています。収量は、他の自動RNA分 離精製システムやフィルターチューブ法による結果と同等、もしくはそれより高いものでした（データ不掲載）。総てのサンプルにおいてOD_260nm/OD_280nm比は2.0±0.1であり、RNAが高純度であることが示されました（表1）。RT-PCRやPCRへの阻害は見られませんでした（データ不掲載）。

スケーラビリティー

2.5～10 mgのマウス肝臓あるいはヒト胎盤から分離精製されたRNAでは、収量（図2）とライトサイクラーでの定量的RT-PCRにおいて、優れたスケーラビリティーが示されました（図3）。

図2: サンプル量に応じた収量のスケーラビリティー。 2.5 mg、5 mg、7.5 mg、10 mgのマウス肝臓よりRNAを分離精製し、その後2.5 μlの溶出液（各サンプル量で2レプリカ）をアガロースゲル電気泳動にかけ、DNA分子量マーカーIII（M）と比較しました。挿し込みのグラフは、OD260nm測定を示したものです。各データポイント（四重測定）の標準偏差はエラーバーで示しています。

図3: 定量的RT-PCRのスケーラビリティー。 2.5 mg、5 mg、10 mgのヒト胎盤（4レプリカ）よりRNAを分離精製しました; 5 μlの各溶出液は、RT-PCRでG6PDH転写産物について評価しました。各データポイントの標準偏差はエラーバーで示しています。

図4: 阻害因子の確認。 10 mgのヒト胎盤よりRNAを分離精製し、液量50 μlで溶出しました。2つの独立した溶出液は10倍の単位で1～1000倍まで希釈し、CycA転写産物についてアッセイを行いました。

図5: DNA混入の確認。 ヒト胎盤からのRNA溶出液中におけるゲノムDNAの残存について、ライトサイクラーによるcycA特異的PCRでチェックしました。2 ngのヒトゲノムDNAを陽性コントロールとし、水を陰性コントロールとしました。

阻害因子の確認

10 mgのヒト胎盤から分離精製されたRNA溶出液を10倍で段階希釈し、ライトサイクラーでの定量的RT-PCRで解析しました。結果のCP値は、希釈倍率に正比例する優れた直線性を示しました。これは溶出液中に阻害因子が存在しないことを証明しています。

クロスコンタミネーション

分離精製工程におけるレーン間のクロスコンタミネーションをチェックするため、5 mgのマウス肝臓から調製した4つのライセートに10⁹コピーのin vitro転 写されたhG6PDH RNAをスパイクし、MagNA Pure Compact装置のポジション1、3、5、7番にセットしました。スパイクしていないライセートはポジション2、4、6、8番にセットしました。分離精 製後、それぞれの溶出液 5 μlをライトサイクラー装置でのRT-PCR（45サイクル）で解析し、hG6PDHの存在を確認しました。スパイクされたサンプルでは増幅シグナルが CP値＝約17で確認された一方、スパイクしていないサンプルは陰性の結果（CP値が算出されない、データ不掲載）が得られました。

PCRで検出可能なDNAの確認

10 mgのヒト胎盤（8レプリカ）から分離精製されたRNAを50 μlの液量で溶出しました。5 μl溶出液をcycAのPCR（ライトサイクラー使用）に使用しました。45サイクル後も増幅シグナルが見られず、ゲノムDNAが残っていないことが示されました。

結論

この新しいMagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue)は、種々のタイプあるいは量の哺乳動物組織からトータルRNAを効率的に自動分離精製するための有用なツールであることが証明されまし た。総ての分離精製ステップはMagNA Pure Compact装置で38分以内に、自動的に実行されました。

分離精製されたRNAは高品質、高純度でした。10 mgの組織からの収量は、マウス脾臓の50 μg超からマウス心臓の約10 μgと様々でした。再現性とスケーラビリティーは優れており、分離精製工程でのクロスコンタミネーションは見られませんでした。RNA溶出液にはRT- PCR阻害因子やPCRで検出可能なDNAは含まれていませんでした。従いまして、この新しいキットはRNA分離精製と解析に価値ある、そして信頼性の高 いツールと言えます。

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関連製品名	製品番号	包装単位	希望価格
MagNA Pure Compact装置	3731146	1台	ご照会
MagNA Lyser装置	3358968	1台	¥774,000
MagNA Lyser Green Beads	3358941	100チューブ	¥42,000

 

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BIOCHEMICA2005 NUMBER4 (No101)