Labレポート ：マウス筋管細胞におけるマーカー膜タンパク質の発現抑制

Gene Knockdown コーナー

氏名／樋口　理
所属／東京医科歯科大学・難治疾患研究所・細胞制御学分野

実験目的

マウス筋芽細胞C2C12は、低血清条件下で培養すると、細胞融合を開始し、数日後には多核の筋管細胞へと分化する。我々は、筋管細胞の細胞膜上に局在するマーカー膜タンパク質の発現量をモニターすることで、筋分化に関与する遺伝子群の機能評価を行っている。

実験方法

1） 1×10⁶個のC2C12細胞を60 mmディッシュに播き込み、高血清培地で培養する。

2） 翌日、siRNA導入を行う。まず、試験管中の200μlのOpti-MEM（GIBCO）に20μlのX-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬を添加し、ピペッティングにより混合する。一方、別の試験管では、200μlのOpti-MEM（GIBCO）に 5μgのsiRNA duplexを添加する。両者をピペッティングにより混合した後に、室温で15分間静置する。この間に細胞の培地をOpti-MEM（3 ml）に交換しておく。siRNA：X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬の混合液を培養液に滴下する。以後、翌日までCO₂インキュベーター内に静置する。

3） 低血清培地に交換する。以後、1日おきに新鮮な培地と交換し、1週間培養を続ける（図1の光顕像は分化後のC2C12筋管細胞を示す）。

4） マーカー膜タンパク質を視覚化するために、蛍光標識された低分子化合物で処理する。細胞固定後、倒立型蛍光顕微鏡を利用し、筋管細胞の膜上のマーカータンパク質を観察する。

実験結果

図1：Alexa 488で標識されたコントロール siRNA（キアゲン社）を、X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬と他社製品とで、それぞれトランスフェクションし、siRNAの導入効率を比較した結果を示す。X- tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬を利用した場合は、顕微鏡視野一面に均一に siRNAが確認された（シアン色の点状のもの）。一方、他社製品の場合では、殆ど siRNAの導入が認められなかった。

図2：遺伝子特異的siRNAをX-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬によりトランスフェクションし、1週間後にアッセイを行った結果を示す。筋分化に関与する遺伝子のノックダウンによ り、マーカー膜タンパク質（マゼンダ色の斑点状のもの）の発現量の減少が観察された。

結論

高密度で培養したマウス筋芽細胞へのsiRNA導入には、X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬は非常に適している。

BIOCHEMICA2005 NUMBER3 (No100)