High Pure PCR Product Purification Kit ： 長鎖DNA断片（4.5 kb～＞30 kb）精製の為の改変プロトコール

Gene Expression コーナー

Ralf Stucka

Neurological Clinic and Polyclinic, Friedrich-Institute, Laboratory of Molecular Myology Ludwig-Maximilians University, Munich, Germany

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High Pure PCR Purification Kit	1732668 1732676	50回精製分 250回精製分	←製品番号をクリック ←製品番号をクリック

キットの特長

• 増幅反応からPCR産物を効率的、簡便に単離するようデザインされています。
• その他の修飾反応、例えば制限酵素消化、アルカリホスファターゼ処理やキナーゼ反応からの核酸の精製がこのキットで可能です。

イントロダクション

High Pure PCR Product Purification Kitは、酵素反応溶液（PCRや制限酵素反応液）やアガロースゲルスライスから簡単にDNA断片を精製出来ます[1]。

DNA断片のガラス繊維フリースへの選択的吸着は、グアニジン塩酸（Binding Bufferに含まれる）などのカオトロピック塩の存在下で起こります。操作手順は次のとおりです。PCR産物などの溶解した状態のサンプルを、5倍量の Binding Buffer 1と混合します。アガロースゲルスライスを55℃で3倍量（アガロースゲル1 mgにつき1量[μl]）のBinding Buffer 1と混合します。続いて、製品説明書に従い、1.5倍量のイソプロパノールをサンプルに加えます。イソプロパノールを加えた溶液をHigh Pure Filter Tubeに加え、13,000×gで30秒間遠心します。さらに洗浄ステップ（Buffer 2で500μl）と溶出ステップ（Buffer 3で50μl以上）を行います。

本記事では、大きいサイズのDNA断片精製の為のイソプロパノール添加ステップを除いた、改変プロトコールを提案します。さらに、2つの一般的なDNA 精製操作（制限酵素反応液からのDNA精製とアガロースゲルスライスからのDNA精製）での、大きいサイズ（30 kb以上）のDNA断片精製における、イソプロパノール無添加で高い回収率が得られた所見を示します。

材料と方法

プラスミドDNA CMV-pAdEasy-1（37.2 kb）は、カナマイシンを含むLuria Bertani（LB）培地で培養されたE. coli BJ5183-AD-1細胞（AdEasy XL Adenoviral Vector System, Stratagene）から抽出しました。

この低コピー数プラスミドはGenopure Plasmid Maxi Kitで抽出されました。PacⅠで分解されたそのDNA産物 は、発現領域を含むアデノウイルスゲノムの大断片（32.7 kb）と、反復配列のpBR322由来配列とカナマイシン耐性遺伝子領域を持つ、小断片（4.5 kb）から成ります。 制限酵素反応産物やアガロースゲル抽出DNA断片は、1×Tris / acetate / EDTA（TAE）バッファー中の0.8%アガロースゲルで電気泳動的に分離しました。

結果と考察

フィルターチューブにイソプロパノールを添加した場合と添加しなかった場合を比較する為に、プラスミドCMV-pAdEasy-1をPacⅠ で分解して分析しました。この制限酵素実験は、32.7 kbと4.5 kbの2つの断片を生じさせ、次の2つの理由から選択されました。

• 32.7 kb断片は、PCRや制限酵素処理など他の実験で一般的に扱われる最大のサイズに分類されます。
• 大きいサイズの32.7 kbと小さいサイズの4.5 kb断片は、ワンチューブで分離できる為、回収効率を直接比較できます。

DNA回収がHigh Pure Filterに添加するサンプル量に依存するかどうかを検証する為に、異なる量（3μgと1μg）のDNAを添加し、分析しました。さらに、イソプロパ ノールの添加は大きいDNA断片を沈殿させ、その結果ガラス繊維への吸着結合を低下させます。そのため、イソプロパノールの添加後、直接フィルターにロー ドするか、フルスピードで10分間遠心するようにしました。

上清はフィルターにロードして処理しました。いくつかの沈殿はゲル電気泳動で直接確認しました。

図1：High Pure PCR Product Purification Kitを使用した制限酵素消化プラスミドDNAの回収。 サンプルはイソプロパノール処理とイソプロパノール未処理としました。選択されたサンプルは、イソプロパノールの添加後にフルスピードで遠心し（S：上 清）、沈殿は滅菌水で再溶解しました（P：沈殿）。コントロール（C）としてPacⅠでCMV-pAdEasy-1プラスミドDNAを分解 して得られた32.7 kb*と4.5 kb断片を用いました。（M：マーカー：λ HindⅢ-Eco RⅠ） * 大きい断片の8%アガロースゲル上での分離能が制限される為、23.7 kbバンドはλ HindⅢ-Eco RⅠDNAラダーの21 kbマーカーの位置に移行します。

制限酵素反応液からの精製

13.3μgのDNA CMV-pAdEasy-1を200μl中で、PacⅠで完全に消化させました。3つの45μl（各3μg DNA）分注と15μl（各1μg DNA）分注を調製し、それぞれに水を加えて100μlに調製しました。制限酵素反応液の残りの20μlは、コントロールサンプルとしてゲル電気泳動に使 用しました。

次に、各サンプルにBinding Buffer 1を500μl加えて良く混ぜ合わせました。イソプロパノール処理サンプルにイソプロパノールを150μl加えました。サンプルは20000×gで10分 間遠心し、上清を注意深く別のバイアルに移しました。ペレットは50μlの水で溶解し、アガロースゲル電気泳動で分析しました。

残りのサンプルをCollection TubeにセットしたHigh Pure Filter Tubeに添加し、13000×gで30秒間遠心しました。フロースルーは廃棄し、500μlのWash Buffer 2をFilter Tubeに加えて、もう一度遠心します。次に、Filter TubeをCollection Tubeから外し、1.5 mlマイクロ遠心チューブにセットしました。各Filter TubeにElution Buffer 3を50μl加え、13000×gで30秒間遠心しました。未精製コントロールDNAとイソプロパノールペレットはもとより溶出DNAを、0.8%アガ ロースゲル（エチジウムブロマイドを含む）にロードし、電気泳動的（100Vで12時間泳動）に分離しました。

全DNA回収効率は、図1の染色されたDNAバンドの強度で視覚的に判定できます。イソプロパノール無添加の精製プロトコールで、より多くの大きな DNA断片が回収できました。これはフィルターにロードしたDNA量に依存しませんでした。興味深いことに、イソプロパノールの添加は沈殿を生じているよ うには見えませんでした。

アガロースゲルスライスからの溶出

13.3μgのPacⅠ処理されたCMV-pAdEasy-1のDNA断片（32.7 kbと4.5 kb）を、アガロースゲル電気泳動で分離し、UV光の下でスライスしました。

32.7 kb断片

32.7 kbのDNA断片スライス（500μg）に、3倍量（1500μl）のBinding Buffer 1を加え、55℃で完全に溶解させます。次に、3つの500μl分注と3つの166μl分注を調製しました。イソプロパノール処理していない2つのサンプ ル（500μlと166μl）は、直接Filter Tubeにロードします。他のサンプルは、1.5倍量のイソプロパノール（187μlと62.5μl）を混ぜ合わせました。サンプルはそれぞれ Filter Tubeにロードし、あるいはフルスピードで遠心して上清をロードしました。遠心で得られた沈殿を溶解し、直接検定しました。

以降の操作（洗浄と溶出）は一般的なプロトコールに従いました。5μlのElution Bufferを使用しました。
アデノウイルス構造物を含んだ抽出DNA断片の生物学的活性を検証し、293細胞にトランスフェクションして確認し、感染性のウイルス粒子を得ました （データ未掲載）。

4.5 kb断片

4.5 kbのDNA断片は312μgのスライスとして得られ、936μlのBinding Buffer 1を加えました。続いて、アガローススライスを55℃で完全に溶解します。2つの625μl分注を調製し、一方にイソプロパノールを234μl加えまし た。両サンプルをHigh Pure Filter Tubeに直接ロードし、32.7 kb断片と並行して操作しました。

少なくとも大量のDNAをロードした場合は、イソプロパノール処理をしていないサンプルから高効率でHigh Pure Filter TubeからDNAを回収しました（図2）。少量のDNAの場合においては、すぐに明らかな違いが出ません。それにもかかわらず、少量のDNAを用いた反 復実験で、イソプロパノール処理サンプルにおいては回収率の低下が見られました（データ未掲載）。4.5 kb断片におけるイソプロパノール処理した場合とイソプロパノール処理しなかった場合の、視覚的に見た回収率の違いはありません。

イソプロパノールの添加後、大きいDNA断片（30 kb以上）の特異的な損失はどのように説明されるのでしょうか？イソプロパノールの追加は、結合バッファーの疎水性を変えている様に見られます。より疎水 性な状況では、DNAの沈殿は生じませんでした。これはイソプロパノール処理サンプルの遠心により確認しました（図1、2）。結合バッファーを含むイソプ ロパノール中でのDNAのガラス繊維への吸着は低下し、その為、いくつかのサンプルはフロースルーで損失している事は無視できません。この可能性は、放射 性標識DNA断片を用いた結合実験を行うことによる確認が必要です。

図2：High Pure PCR Product Purification Kitを使用したアガロースゲルスライスから抽出されたDNA断片の回収。 サンプルはイソプロパノール処理とイソプロパノール未処理としました。選択されたサンプルは、イソプロパノールの添加後にフルスピードで遠心し（S：上 清）、沈殿は滅菌水で再溶解しました（P：沈殿）。コントロール（C）としてPacⅠで分解したCMV-pAdEasy-1プラスミド DNAを用いました。（M：マーカー：λ HindⅢ-Eco RⅠ）

結論

High Pure PCR Product Purification Kitを用いた、DNA断片精製の為の一般的なプロトコールの単純な改良は、一般的に行われる実験を簡単にします。イソプロパノール添加ステップを除くこ とにより、High Pure Filterを通過する全量を減らすことができます。さらに重要なことは、様々なDNA断片のサイズの－特に大きい断片－回収効率は、イソプロパノール添 加プロトコールと同じかそれ以上の効率を達成します。

リファレンス

1. Roche Applied Science; Nucleic Acid Isolation and Purification（2003）2^nd edition

 

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Genopure Plasmid Maxi Kit	3143422	10回精製分	←製品番号をクリック

BIOCHEMICA2005 NUMBER3 (No100)