X-tremeGENE siRNA Dicerキット：高品質なsiRNAを24時間以内に調製します

Gene Expression コーナー

Andrea Gräntdörffer, Claudia Kirr, and Manfred Watzele
Roche Applied Science, Penzberg, Germany

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
X-tremeGENE siRNA Dicerキット	4579020	10回反応	¥88,000

キットの特長

• siRNAプールによる効率的なジーンノックダウン
• 低毒性：夾雑の長鎖dsRNAが無い/li>
• 非特異的なオフターゲット効果の低減：それぞれ低濃度のsiRNAミックス
• dsRNAが高収量：少なくとも40μg/in vitroトランスクリプション反応
• 高純度のd-siRNAの作成：30μgのdsRNAから10μgのd-siRNAが作成可能
• 簡便：In vitroトランスクリプションは3ステップで3.5時間、Dicingはオーバーナイト、精製は2ステップで40分

X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬との組合わせで、これらの特長がますます生かされます！

キットの原理

X-tremeGENE siRNA Dicerキットでは、至適化されたT7 in vitroトランスクリプションシステムが、両端にT7プロモーター配列を持つDNAテンプレートから、長鎖のdsRNAを高い収量で合成するために使用されていま す。次に、リコンビナントのDicer酵素が、dsRNAを21～23bpのsiRNAのミックスに切断するために適用されます。最後に、高純度のd- siRNAを得るために、残余の未切断dsRNAを除去します。残余の長鎖dsRNAは、哺乳類細胞において非特異的なインターフェロン応答の原因となる ため、d-siRNAの純度が大変に重要です。

材料と方法

d-siRNAの合成

HPRT、PIN1、LaminA/C、EG5をコードしたヒト遺伝子のDNAテンプレートはRZPDドイツリソースセンター（Heidelberg, Germany）より獲得、あるいはT7プロモーターを含むプライマーを使用したPCR増幅で作成しました。両端にT7プライマーを含むDNAテンプレー トは、記載のない場合には、300 bp長で遺伝子のコーディング部位や3'-未翻訳部位（3'UTR）に対向しています。

トランスフェクション

24ウェルプレート中で、指数増殖期のHeLa細胞（2.5×10⁴細胞／ウェル）を、10% (v/v)のFCS、2 mMのL-グルタミン酸を含むイーグルの最小必須培地に播種しました。オーバーナイト増殖の後、細胞を、2.5μlのX-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬を使用して67 nMのsiRNA、あるいは、1μlのX-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬を使用して27nMのsiRNAでトランスフェクションしました。ジーンノックダウンの分析はトランスフェクションの 2日後に行いました。

mRNAレベルでのジーンノックダウンの分析

NAはHigh Pure RNAアイソレーションキットで分離し、トランスクリプターファーストストランドcDNA合成キットで逆転写しました。その後、ライトサイクラーファストスタートDNAマスター^PLUSSYBR Green Iを使用し、ライトサイクラーにより定量リアルタイムPCRを行いました。

細胞増殖アッセイ

細胞増殖試薬WST-1を使用して、トランスフェクション／未トランスフェクション細胞の増殖アッセイを行いました。

結果と討論

様々なサイズのテンプレートからのd-siRNAの合成

X-tremeGENE siRNA Dicerキットを、様々なサイズのPCRフラグメント（158～1,000 kb）からのd-siRNAの作成に使用しました。図2に見えるように、Dicerは、サイズに係わらず、効率的にdsRNAを切断しています。その上、 キット内のカラムを使用したd-siRNAの精製は、未切断のdsRNAの夾雑が無い明瞭なバンドとして行われます。これは、トランスレーションを停止さ せる原因となるインターフェロンが介在する応答を避けるために必須です。回収されたd-siRNAはジーンサイレンシング実験に使用され、テストされたす べてのサンプルで80%以上のノックダウン効率が達成されました（データ不掲載、HPRTは図4）。

図1：X-tremeGENE siRNA Dicerキットの作動原理。

図2：X-tremeGENE siRNA Dicerキットで作成された精製d-siRNAの分析。 さまざまな長さのPCRテンプレートがin vitroトランスクリプションに使用されました。アニーリングされたdsRNAは次にDicer酵素により切断され、d-siRNAが精製された。反応液の1%量を20%のポリアクリルアミドゲルで分析しました。

他のサプライヤーのキットを使用したsiRNAの合成

様々なサプライヤーからのキットを使用して、ヒトHPRTの158 bpフラグメントとヒトPIN1の300 bpフラグメントからsiRNAを作成しました（図3、PIN1はデータ不掲載）。

X-tremeGENE siRNA Dicerキットは精製後、きれいな産物が得られましたが、他のサプライヤーのDicerを含む2つのキットでは、精製後に未切断dsRNAのより多い夾 雑が見られました（図3、レーン5と7）。さらに、サプライヤーIIの精製用ツールは未切断の材料を分離できませんでした。この強い夾雑は、おそらくアポ トーシスの原因となる長鎖dsRNAによるインターフェロン応答による、トランスフェクション後の高い細胞毒性をもたらしました（図4）。

d-siRNAと化学合成siRNAとの比較

別の実験において、ヒトPIN1遺伝子のin vitro トランスクリプションされた300 bpフラグメントから作成したd-siRNAと、PIN1特異的化学合成siRNA（4種類の異なるsiRNAプールからの最も高いノックダウン活性を持 つ1つ）を比較しました。X-tremeGENE siRNA Dicerキットで得られたd-siRNAは化学合成siRNAよりも高活性でした。in vitroトランスレーションによるd-siRNAは27 nMの低濃度でも80%以上のノックダウンを示したのに対し、化学合成では67 nMの濃度で75%、27 nMでは僅か50%のノックダウン効率でした（図5）。

In Vitroトランスクリプションとdicingで作成されたsiRNAの優位点が、明白になってきました：化学合成siRNAは1種類のsiRNAしか含まないのに 対し、このキットでは多数のsiRNAが作成されます。これはサブセット内に存在する至適siRNAの蓋然性を高め、至適なsiRNAのスクリーニングを 必要としません。それに加え、多様なsiRNAはsiRNA濃度を最小限にすることを可能にするため、細胞毒性の副次効果を最小限にします。

まとめ

様々な長さのPCRテンプレートがin vitroトランスクリプション用のテンプレートとして作成されました。これらのDNAテンプレートのサイズに係わらず、トランスクリプションにより多量の dsRNAが得られ、切断と精製が効率的に行われ、均一なd-siRNAポピュレーションが得られました。すべてのd-siRNAは至適化の必要なく、相 当するmRNAを効率的にノックダウンしました。
ノックダウン効率に関して、X-tremeGENE siRNA Dicerキットで作成したd-siRNAは、他のサプライヤーのキットのみならず、化学合成siRNAよりも優れていました。

図3：それぞれのキットの説明書に従い、HPRT特異的d-siRNA の合成を行いました。

図4：ジーンノックダウンと生存活性の分析。 HPRT特異的siRNAを様々なサプライヤーのキットで、168bpのPCRテンプレートから合成しました。HeLa cellにsiRNAをトランスフェクションした2日後にジーンノックダウンと細胞増殖をアッセイしました。

図5：d-siRNAと化学合成siRNAの比較。 PIN1遺伝子に特異的なsiRNAはX-tremeGENE siRNA Dicerキットで合成し、ノックダウンは27 nMと67 nMの量において、合成siRNAと比較しました。

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬	4476093 4476115	1 ml(400回*) 5×1 ml(2000回*)	¥23,000 ¥92,000
High Pure RNAアイソレーションキット	1828665	50回反応	¥32,700
トランスクリプターファーストストランドcDNA合成キット	4379012	30回反応	¥43,000
ライトサイクラー2.0インスツルメント	3531414	1台	ご照会
ライトサイクラーファストスタートDNAマスターPLUSSYBR Green I	3515869	96回反応	¥26,400
細胞増殖試薬WST-1	1644807	2500テスト	¥44,900

*24ウェルプレートでトランスフェクションを行った場合の回数です。

BIOCHEMICA2005NUMBER2(No99)