mRNA Capture Kitを使用した単一細胞からのポリ[A]RNAの分離

Gene Expression コーナー

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
mRNA Capture Kit	1787896	1キット （192反応分）	¥49,000

本レポートで使用されているキットは、mRNA Capture Kitです。mRNAの特徴であるポリ[A]を利用したmRNA抽出精製キットです。このポリ[A]テールとビオチン標識オリゴ[dT]の相補的結合に基づき、選択的にmRNAを回収します。

特長

• 0.2 ml PCRチューブ内でmRNAを固相化しますので、そのままRT-PCRが行えます。
• 特にmRNA量が少ない場合や、サンプル量が限られている場合に有用です。

キットのフローダイアグラム

イントロダクション

浮遊型繊毛虫Paramecium containsのマルチジーンファミリーを含むゲノムは、それぞれ250～300 kDaの高分子量タンパク質をコードしています。これらのタンパク質は原生生物の膜表面に局在し、グリコシルフォスファチジルイノシトール（GPI）アン カーにより固定されるため、表面抗原と呼ばれています[1]。

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Parameciumは、細胞表面に様々なタイプの表面抗原を提示します。一般的に、全ジーンファミリーの内、一つの遺伝子が発現し、細胞表面のタンパク質層はセロタイプと呼ばれる一種類のタンパク質から成ります。Parameciumのような寄生性原生生物の表面抗原と、これらタンパク質との比較は、インターナルタンデムリピートや保存されたシステイン周期性を共有するいくつかのタンパク質ファミリーを示します。

さらに、一般的な原生生物では、一定の環境では一種類のタイプの表面抗原だけが限定的に発現します。Parameciumのセロタイプ発現の根拠は解明されていませんが、寄生性原核生物は宿主免疫機構に対する防衛機構としてのセロタイプシフティングを行います。
セロタイプはParameciumに必須の性質と考えられています。欠失変異とRNAiノックダウン実験においては、他のセロタイプが発現されます [2]（Simon, unpublished）。

Parameciumにおける表面抗原の発現は、対応する抗血清を培養培地に加えることにより、タンパク質レベルで簡単に検出できます。しかしながら、この従来の免疫学的試験は交叉反応があるため、Paramesium tetraureliaには使えません[3、4]。別法として、我々はmRNA Capture Kitで単一のParamecium細胞からmRNAを抽出し、RT-PCRによりセロタイプ特異的な転写を捕らえました。

材料および方法
細胞培養とセロタイプシフティング

菌株50-d48（P. tetraurelia）、60、156（P. primaurelia）をKlebsiella minutaと共に、β-シトステロール（0.8mg/l）を添加した小麦若葉粉末（wheat grass powder; WGP）培地で培養した。Sタイプ発現の菌株60と菌株156の培地は、核分裂率を下げるために水（β-シトステロール不含）で1：1に希釈しました。セ ロタイプ60Sと156Sを発現する細胞は、1日に一回以下の分裂率で、10℃で培養しました。51Hから51Dへのセロタイプシフティングは、15℃（P. tetraureliaで安定してセロタイプHを発現[5]）から28℃（セロタイプDに特異的な温度[6]）に急激に温度を変えることで誘導しました。

図2：P. tetraureliaにおける、セロタイプH（15℃で発現）からセロタイプD（28℃で発現）へのセロタイ プシフティングが、全ての培養で示されました。適当な数の細胞は2種のセロタイプに特異的なプライマーで分析されました。RNAは、セロタイプHの細胞を 28℃に温度変更後、0時間、15時間、40時間の単一細胞から抽出されました。 （レーンCはDNAコンタミネーションのコントロール）

スライド

抽出、洗浄、ライシスはSonneborn沈下スライド（3つに別れた沈下とグラスバー）で行いました。スライドは、酵素のコンタミネーションを防ぐために、クロロホルムで3回洗浄し、200℃で48時間インキュベートしました。

細胞の単離

細胞の単離は双眼顕微鏡を用いて行いました。生細胞は滅菌ろ過したミネラルウォーターで3回洗浄しました。個々の細胞を1～2μl容積に分離し、1μl の150mM 1,4-ジチオスレイトール（DTT）液滴と0.5μlのRNaseインヒビター（40ユニット/μl）液滴の間に液滴として置きました。 それぞれの3滴は混和させず、3滴は47.5μlのmRNA Capture Kitのライシスバッファー中で混和しました。

RNAの単離

DNAは、ライシスバッファー中の細胞を21ゲージ針に数回通すことで分離しました。続いて、キット中の0.2μl（0.02 nmol）ビオチン標識オリゴ[dT]プローブをミックスチャーに加え、ポリ[A]とオリゴ[dT]プローブをハイブリダイズさせるため37℃で10分間 インキュベートしました。
このミックスチャーをストレプトアビジンコート済みPCRチューブに移した後、キャプチャーしたmRNAを固定するために、再度インキュベートしました。最終的に、氷冷した250μlの洗浄バッファーを用いて3回洗浄しました。

結果と考察
遺伝子検出

我々は、mRNA Capture法を用いて単一のParamecium細胞からRT-PCR分析に十分なテンプレートRNAを抽出出来ました。それぞれの細胞の発現反応は異なるのに対し、ノーザンブロットでは全培養細胞の状態のみしか解析できないので、この単一細胞を解析出来る能力は、非常に有用です。

我々は、培養温度などの環境条件に大きく左右される表面抗原の発現について、Parameciumを分析しました。低温時の低代謝速度における、RNAレベルでの遺伝子発現検出は特に困難です。そのため、極めて高感度なシステムが必要とされています。

我々は、P. primaureliaのセロタイプSをコードした未知遺伝子の発現を検出することが出来ました。大核DNAから想定遺伝子を単離し、免疫蛍光染色により同時に検出されたSタン パクの異常発現と関連付けました（データ不掲載）。よって、セロタイプSは低温セロタイプと同定しました。同時に、我々は、培養中の分裂速度が、予想以上 にセロタイプ発現に影響を及ぼすことを確認しました。我々はmRNA Capture Kitを使用して、低温培養の飢餓細胞からmRNAを単離出来ました。図1に600bp断片を見ることが出来ます。
各サンプル中に300塩基対のコントロール断片が見られないことは、mRNA単離の際にDNAが定量的に除去されたことを示しています。

現在、セロタイプS遺伝子とP. primaureliaの通常発現のセロタイプのシークエンスデータは完成しています。他のジーンファミリーとの配列比較は、ほぼ完全なタンデムリピートからなる中央部のみであり－免疫学的検出に関与が想定されるエピトープの情報を持っていることが示されます。
これはセロタイプ機能におけるタンデムリピートの役割の研究として興味深いことです。

セロタイプシフティング

その後の、P. tetraureliaのセロタイプシフティング実験は、“新しい”mRNAの早期出現や転写がタンパク質プロセッシングに密接に関連するにもかかわらず、遺伝子発現の再編成よ りも時間がかかることを示しました。新しいセロタイプのmRNAは開始後12～15時間以内で検出されるのに対し、タンパク質は3日たつまでは細胞表面に 局在しません（データ不掲載）。この現象は、タンパク質へのGPIアンカーの付加などのプロテインプロセッシングステップと、タンパク質の細胞表面への輸送に関係しています。

最後に、Parmeciumの表面タンパク質は表面を覆うタンパク質だけではありません。免疫学的に関連のあるタンパク質内部構造内のエピトープの存在と、新たな合成における長期のプロセッシング時間は、それらは未知の特別な機能を持つと結論づけます。
GPIアンカーの存在は、2次的メッセンジャーシステムとして機能し、シグナル伝達における表面抗原の役割を暗示します。さらに、表面抗原は捕食－被食関係における隠れた機能をもっているかもしれません。

結論

ロシュ・ダイアグノスティックスのmRNA Capture Kitで、我々はmRNAの微量を単離するための優秀、高感度、高品質な方法を得ました。現在、非常に微量なRNAを用いた研究が可能になっています。

参考文献

1. Capdeville Y, Cardoso de Almeida ML, Deregnaucourt C (1987) Biochem Biophys Res Commun 147: 1219-1225
2. Epstein LM, Forney JD (1984) Mol Cell Biol 4: 1583-1590
3. Beale GH (1954) The genetics of Paramecium Aurelia, Cambridge Univ. Press, New York
4. Kusch J, Schmidt HJ (2000) J Membrane Biol 180: 101-109
5. Breuer M et al, (1996) J Euk Microbiol 43: 314-322
6. Godiska R (1978) Mol Gen Genet 208: 529-536

著者：Martin C. Simon
Division of Ecology, Research Group Molecular Ecology, University of Kaiserslautern, Germany

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関連製品名	製品番号	包装単位	希望価格
Protector RNase Inhibitor	3335399	2,000ユニット	¥24,000
	3335402	10,000ユニット	¥96,500
1,4-Dithiothreitol	197777	2g	¥11,300

新発売情報！！
High Pure 96 UF Cleanup System

図：High Pure 96 UFクリーンアップシステムのスキーム。

限外ろ過を利用したハイスループット高純度PCRプロダクト精製キットです。
このキットは96ウェルプレートプラットフォームで、遠心分離機、バキュームマニホールドのいずれの機器でも使用できるキットです。

■製品スペック
抽出サンプル：PCR増幅プロダクト
サンプル量：20～300μL
精製断片長：150～10000 bp
溶出量：25～μL
回収率：50～95%（PCR産物長に依存）
処理時間：20分
ロボットへの対応：様々な分注ロボットへの対応が可能です。

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
High Pure 96 UF Cleanup Kit	4422694	High Pure 96 UF Cleanup Plate×2枚	¥31,100
		廃液用プレート×2枚
		溶出用プレート×2枚
		洗浄バッファー 100ml
		溶出バッファー 100ml
High Pure 96 UF Cleanup Plates	4422716	High Pure 96 UF Cleanup Plates×10枚	¥50,000

BIOCHEMICA2005NUMBER1(No98)