-X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬- 哺乳類細胞株におけるsiRNAデリバリーの進歩

ジーンノックダウン コーナー

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
X-tremeGENE siRNA トランスフェクション試薬	4476093	1 ml(400回*)	¥23,000
	4476115	5×1 ml(2000回*)	¥92,000

*24ウェルプレートでトランスフェクションを行った場合の回数です。

特長

• 効率的なノックダウン─トランスフェクションの難しい細胞でも成功
• 低毒性─細胞増殖試薬WST-1による品質管理
• 柔軟性─プラスミドとのコトランスフェクションも可能

はじめに

RNA干渉（RNAi）はほとんどすべての真核生物において効果的な、ポストトランスクリプションの遺伝子サイレンシング機構です。RNAi機構はレト ロウイルスの侵襲に対抗するための、進化的に保存された防御機構です。RNAiイベントの中心的な部分は、細胞質中の二重鎖RNA（dsRNA）上に形成 されるRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）の活性化です。RISCはdsRNAを巻き戻し、mRNAターゲットを認識するためのテンプレートとし ての一本鎖の相補的RNAをリクルートします。RISCによる認識の後、mRNAは複合体の成分であるRNaseにより切断されます。ここ数年に、研究者 は実験系においてターゲット特異的な遺伝子サイレンシングを行うためのRNAiを使用するために、短い干渉RNA（siRNA）を使用することを学びまし た。このsiRNAはRISC酵素を活性化できる19から25-bpのdsRNAです。

siRNAを使用する際の重要なファクターは、培養細胞へのsiRNA導入に成功することです。siRNAはしばしばトランスフェクション試薬を用いて 導入されますが、いくつかの細胞株では効率的なsiRNA導入は困難です。トランスフェクション試薬の厄介な問題点のひとつは、アプライする濃度において 細胞毒性を発揮することです。

ここでは、X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬による、市販のリポフェクション試薬では困難かトランスフェクション出来ない哺乳類細胞株（表1）へのsiRNAの導入成功について記述します。

表1. トランスフェクションされた細胞株

細胞株	種	組織
MCF-10A	ヒト	乳腺上皮
MDA-MB-468	ヒト	乳がん
HUH-7	ヒト	肝臓がん
WI-38	ヒト	肺線維芽細胞
NIH3T3	マウス	胎児性線維芽細胞
MEF	マウス	不死化線維芽細胞

材料と方法

ヒト細胞株

ヒト乳腺上皮細胞であるMCF-10A、ヒト乳がん細胞のMDA-MB-468、ヒト肝臓がん細胞のHUH-7、ヒト肺線維芽細胞のWI-38を、 Glutamaxと10% FCS、ペニシリン／ストレプトマイシン（100 U/mlと100μg/ml）を含むRPMI培地中の6ウェルプレート（70-80 x 10³細胞/ml）に播種しました。細胞は遺伝子XをターゲットとするsiRNAおよびコントロールとしてのミスマッチsiRNAによるトランスフェクションの24時間前に播種されています（siRNAは両者ともDharmacon Inc., USA）。

ヒト細胞株のトランスフェクション

トランスフェクションはX-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬を用いて2 mlの血清添加培地中で行いました。siRNAは100μlの無血清RPMI培地中で予め希釈します。次に、2-5μlのsiRNAトランスフェクション 試薬を100μlの無血清RPMI培地中で希釈し、メーカーの推奨どおりに、siRNA希釈液と混合しました。200μlの混合液を室温で20分間イン キュベートした後、細胞に加えました。反応ミックスの最終液量は2.2 ml/ウェルで、siRNAの終濃度は50 nMです。

マウス細胞株

マウス胎児性線維芽細胞株であるNIH3T3と野生型の自発的なマウス不死化線維芽細胞（MEF）を、Glutamaxと4.5 g/lのグルコース、熱非動化FCS、0.1 mMの非必須アミノ酸、 ペニシリン／ストレプトマイシン（100 U/mlと100μg/ml）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で増殖しました。細胞は2.5 x 10⁵細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに20時間蒔き、トランスフェクションの前に2 mlの増殖培地に変更しました。

マウス細胞株のトランスフェクション

遺伝子Yに対する特異的siRNAおよびコントロールとしてのミスマッチsiRNAは、100μlの無血清DMEM培地中で予め希釈しました。3μlの siRNAトランスフェクション試薬を100μlの無血清DMEM培地中で希釈し、siRNA希釈液と混合しました。室温で20分間のインキュベーション の後、混合液を細胞に加えました。反応ミックスの最終液量は2.2 ml/ウェルで、siRNAの終濃度は100 nMです。

トランスフェクションされた細胞の生存活性は、24時間ごとに位相差顕微鏡で評価しました。72時間後、細胞を溶解しタンパク質XとYに対する抗体でのウェスタンブロットのために調製しました。

結果と討論

MCF-10A、WI-38、HUH-7、MDA-MB-468、NIH3T3、MEFがsiRNAのトランスフェクション後、ウェスタンブロットで分 析された。図1に表示されたsiRNAとX-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬の濃度で、コントロールに対して、タンパク質XとYが70%以上の消耗が観察されました（図1）。トランスフェクショ ンから細胞の採取までの間に、毒性の兆候は見られませんでした。

MCF-10A、WI-38、HUH-7、MDA-MB-468細胞では、ジーンノックダウンの成功にはsiRNAの濃度はさほど重要ではないことがわか りました。20 nMから100 nMのsiRNA濃度を使用した時、ノックダウン効率には顕著な差がないことを観察しました（データ不掲載、表2に要約）。これらの細胞では、20 nM以下の濃度のX遺伝子siRNAが、X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬での効率的なサイレンシングに十分でした。

NIH3T3とMEF細胞はX-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬で効率的なトランスフェクションが行われ、ノックダウン後のタンパク質の発現は10-20%で、他の市販のトランス フェクション試薬より効率的でした（データ不掲載）。これらの細胞では、6ウェル当り4μl以下のトランスフェクション試薬の使用で、毒性がなく、遺伝子 Yを効率的にノックダウンしました。100 nMの終濃度のsiRNAでは50 nMよりもより消耗させました（データ不掲載）。

図1：ヒト乳腺上皮細胞であるMCF-10A、ヒト乳がん細胞のMDA-MB-468、ヒト肝臓がん細胞のHUH-7、ヒト肺線維芽細胞の WI-38、マウス胎児性線維芽細胞株であるNIH3T3と野生型の自発的なマウス不死化線維芽細胞（MEF）を、遺伝子Xと遺伝子Yに対する特異的 siRNAおよびコントロールとしてのミスマッチsiRNA（C）との複合体中、X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬によるトランスフェクションの72時間後に、ウェスタンブロットで分析した。ローディングはグリセロアルデヒドリン酸 脱水素酵素（GAPDH）の検出により確認された。 *抗Xタンパク質抗体で検出された非特異的バンド。

表2. さまざまなsiRNA濃度を使用してのトランスフェクション効率

細胞株	siRNA濃度(nM)	ノックダウン効率(%)
MCF-10A	20	> 70%
	50	> 70%
	100	> 70%
MDA-MB-468	20	> 70%
	50	> 70%
	100	> 70%
WI-38	20	> 70%
	50	> 70%
	100	> 70%
HUH-7	20	> 70%
	50	> 70%
	100	> 70%

われわれの見解では、X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬は哺乳細胞株へのsiRNA導入において、効率的で無毒性のすばらしい試薬です。

著者：Mads Daugaard
The Apoptosis Laboratory, Institute of Cancer Biology, The Danish Cancer Society, Copenhagen, Denmark

BIOCHEMICA2004NUMBER4(No97)