-MagNAライザーとTriPureリェージェント- 組織のホモジナイズとトータルRNAの抽出

ジーン エクスプレッション コーナー

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
TriPureリェージェント	1667157	50 ml	¥20,900
	1667165	200 ml	¥69,600

特長

• 簡便─DNA、RNA、タンパク質の分離がこれ1本で可能

はじめに

MagNAライザーは、核酸精製の前処理として、自動的に組織や他の生体試料を破砕するための機器です。これは、MagNA Pure LC抽出キットとの組み合わせでの使用に至適化され、ロシュ・ダイアグノスティックスのPCRワークフロー：核酸の抽出用のMagNA Pure LCシステムとLCカローセル遠心器、リアルタイムPCRのライトサイクラーシステムに統合されます。

MagNAライザーによる細胞破砕の基本原理は、ローターの高速往復振動の動きです。細胞の破砕は、サンプルとセラミックビーズの摩擦により起こります。

この実験の目的は組織からトータルRNAを抽出するために、MagNAライザーと組み合わせてのTriPureリェージェントの効率を評価することでし た。TriPureアイソレーションリェージェントは、同一サンプルからトータルRNA、DNA、タンパク質を液相ベースにより1ステップで分離できま す。この試薬は、ヒト、動物、植物、バクテリア由来の組織で、スケールにかかわらず、良好に作動します。われわれは、両者のアプリケーションを拡げるため に、MagNAライザー機器と、フェノールとグアニジンチオシアネートを含むTriPureリェージェントを一緒に使用しました。

材料と方法

動物

8週齢のC57Bl/6マウスをチャールズリバーより購入し、標準的な畜舎で維持しました。

トータルRNAの分離

組織検体は直接に使用、採取後に液体窒素で凍結、あるいはRNA Later溶液（Qiagen, Benelux, Netherlands）中で保存しました。RNA Later溶液は動物組織や他の生体試料中のRNAを保護し、室温での輸送と保存を可能にします。トータルRNAは TriPureリェージェントを使って使用説明書に従い抽出されました。MagNAライザーでの調製過程は以下の通り：肝臓、すい臓、腸、脾臓には 6,500 rpmで1ラン50秒;尾では6,500 rpmで3ラン各30秒。

トータルRNAの量と純度

RNA量は260 nmの吸光度で測定、RNAの純度は260 nmと280 nmの比で測定しました。

ハウスキーピングβ-アクチン遺伝子のリアルタイムPCRによるmRNAの定量

最初に、トランスクリプター リバーストランスクリプターゼで逆転写を行いました。ハウスキーピングβ-アクチンをmRNA量の定量に使用しました。ライトサイクラー ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションキットを以下の条件で使用しました：300 nMのプローブ、300 nMの各プライマー、25 mMのMgCl₂。増幅のサイクル条件は以下の通り;95℃で10分間のプレインキュベーション、95℃で0秒と60℃で20秒の45サイクル（温度のランプは20℃/s）。

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結果と討論

MagNAライザーとTriPureリェージェントを使用して抽出したトータルRNAとmRNA量を測定するために、260 nmの吸光度の測定と、ライトサイクラー機器を使用したβ-アクチンのリアルタイムRT-PCRを行いました。興味深いことに、MagNAライザーと TriPureリェージェントの使用により、肝臓、すい臓、腸、脾臓、尾から大量のRNAとmRNAが抽出できました（表1、図1）。A_{260 nm}/A_{280 nm}の比率は、高純度のDNA/RNAが同時にこれらの組織から抽出されたことを示しています。

表1. RNA Later溶液の添加とTriPureによる抽出後のRNAの量と純度

肝臓（mg）	100	100	100	100
RNA Later（ml）	─	─	0.5	1
TriPure（ml）	0.5	1	0.5	0.5
トータルRNA（μg/μg）*	0.429	0.381	0.203	0.408
A260 nm/A280 nm	1.88	1.86	2.03	1.99
脾臓	80	80	─	80
RNA Later（ml）	─	─	─	1
TriPure（ml）	0.5	1	─	0.5
トータルRNA（μg/μg）*	0.198	0.328	─	0.205
A260 nm/A280 nm	1.87	1.89	─	1.83
すい臓	80	80	80	─
RNA Later（ml）	─	─	0.5	─
TriPure（ml）	0.5	1	0.5	─
トータルRNA（μg/μg）*	0.6	0.429	0.519	─
A260 nm/A280 nm	1.61	1.88	1.94	─
腸	40	40	─	40
RNA Later（ml）	─	─	─	1
TriPure（ml）	0.5	1	─	0.5
トータルRNA（μg/μg）*	0.31	0.587	─	0.43
A260 nm/A280 nm	1.83	1.66	─	1.91
尾	20	20	20	─
RNA Later（ml）	─	─	0.5	─
TriPure（ml）	0.5	1	0.5	─
トータルRNA（μg/μg）*	0.059	0.405	0.542	─
A260 nm/A280 nm	2	1.86	1.7	─

*すべてのサンプルは等量のDEPC処理水で希釈されています。

われわれは使用説明書に述べられたように、TriPureリェージェント量の適応が抽出効率を増大させることを示しました。抽出過程でRNAを安定化さ せるRNA Laterは、すい臓など大量のRNaseを含む組織に効果的のように思えます。他の組織サンプルでは、TriPureリェージェントのみで安定化には十分でした。

図1：マウスのさまざまな組織中のmRNAコピー数。 サンプルはRNA Laterの存在/不在下で、さまざまなTriPureリェージェント量で抽出しました。

著者：Eric Quertinmont
Laboratory of Experimental Gastroenterology, Free University of Brussels, Belgium

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関連製品名	製品番号	包装単位	希望価格
トランスクリプターリバース トランスクリプターゼ	3531317	250 U(25回)	¥16,000
	3531295	500 U(50回)	¥27,000
	3531287	2000 U(200回)	¥100,000
ライトサイクラー ファストスタートDNAマスター ハイブリダイゼーションプローブ	3003248	96回	¥27,800
	2239272	480回	¥111,400
MagNAライザー機器	3358968	一台	ご照会
MagNAライザー グリーンビーズ	3358941	1セット	¥42,000

BIOCHEMICA2004NUMBER4(No97)