-GenoPureキット- トランジェントなトランスフェクションに使用するDNAプラスミドの迅速で簡便な精製キット

ジーン エクスプレッション コーナー

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
GenoPureプラスミド マキシキット	3143422	10回	¥18,900

特長

• 500μgまでのプラスミドDNAの分離
• フィルターの使用により遠心操作がいりません
• 高コピー数のプラスミドのバクテリア培養液30-150 mlから10回分離

はじめに

SDSと組み合わせたアルカリ溶解法は、15 kb以下のプラスミドDNAの調製法として一般的なものです。真核細胞へのトランスフェクションなどの厳しいアプリケーションにDNAを使用する際には、 RNAやタンパク質、炭水化物などを除去する必要があります。ここ十年来、クロマトグラフィーを使用した市販キットが、時間のかかる塩化セシウム密度遠心 勾配法に代わり使用されてきました。新しいシステムを評価する際に、標準法として比較測定されるのは、プラスミドDNAを結合および溶出させるためのジメ チルアミノエチル（DEAE）陰イオン交換シリカビーズを採用したキットです。われわれは、頻繁にこれらのキットを使用していますが、今回、ジェノピュア プラスミド マキシキットと比較しました。

キット内容

ボトル	ラベル	内容/機能
1	懸濁バッファー	・バクテリアのペレットを懸濁
2	RNase A	・懸濁バッファーに溶解
3	溶解バッファー	・バクテリアの溶解
4	中和バッファー	・細胞残渣の安定な沈殿を形成
5	平衡化バッファー	・使用前にカラムを平衡化
6	洗浄バッファー	・残った不純物の除去
7	溶出バッファー	・プラスミドの溶出
8	ヌクレオボンドAX500カラム	・分離ステップに使用
9	フィルターろ紙	・遠心操作が不要 ・細胞残渣の除去
10	シーリングリング	・試験管内にカラムを立てる

われわれの結果は、ジェノピュアキットがほとんどの分子的アプリケーションに最適な高純度のプラスミドDNAを迅速かつ簡便に得られることを示しました。

材料と方法
DNAの調製

2種類の高コピー数のプラスミドであるpBCL-2とpRP16を実験に使用しました。プラスミドpBCL-2はpBL3ベクターにヒトbcl-2プロ モーターをクローニングし、pRP16はラットp16プロモーターをpGL2にクローニングしてあります。両方のプロモーターはホタルルシフェラーゼの発 現をもたらします。トランスフォームされたDH5α E. coliを200 mlのLB培地中で一晩増殖し、DNA分離の前に等量に分注しました。プラスミドはそれぞれの使用説明書どおりに調製しました。制限酵素消化の後、DNAを1.5%アガロース/0.2×トリス酢酸-EDTA（TAE）ゲルで分析しました。

トランスフェクション

ヒトの肺上皮細胞株A549とCalu-3をプラスミドpBCL-2でのトランスフェクションに使用し、ラットの腫瘍細胞R623と1149を pRP16でのトランスフェクションに使用しました。24ウェルに播種された細胞はトランスフェクションの日には20%のコンフルエントでした。すべての トランスフェクションはFuGENE 6で行いました。プラスミド（0.2μgのpBCL-2あるいは0.4μgのpRP16）は、0.1μgのウミシイタケのルシフェラーゼ発現ベクター pPL-TKとコトランスフェクションされました。ウミシイタケのルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ発現の較正用の内部コントロールとして使用され ます。使用説明書に従い、FuGENE 6とDNAの比率は2：1（μl：μg）として、すべての実験に使用しました。トランスフェクションは1個の細胞につき2回行い、再度繰り返しました。ト ランスフェクションの48時間後に細胞を溶解し、発現はデュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）で分析しました。

結果と討論

われわれは2種類のキットで効率を比較しました。ほぼ同量のDNAが分離され（表1）、プラスミドの純度もアガロースゲル電気泳動（図1a）と制限酵素消化（図1b）でチェックしました。

表1. pBCL-2とpRP16から分離されたDNAの量。プラスミドは100 mlのDH5α E. coli培養から、従来のキットとGenopureプラスミドマキシキットを使用して調製されました。

プラスミド	キット	μg DNA/ml培養	μg DNA/mgバクテリア
pBCL-2	従来法	3.43	0.49
	Genopure	2.95	0.35
pRP16	従来法	4.62	0.77
	Genopure	5.60	0.80

図1：1.5%アガロース/0.2×TAEゲルでのプラスミドDNAの分析。 (a) 0.3μgのスーパーコイルプラスミドDNAをそれぞれ、従来法のキット(A)とGenopure (G)で調製し、ロードしました。 (b) pBCL-2をHind III/Kpn I、pRP16をMlu I/Bgl IIで消化し、それぞれ2.6 kbと0.16 kbのプロモーターフラグメントを遊離させました（矢印）。M： 1 kb DNAラダー

Genopureキットでは、より多くの収量と高い純度のDNAが調製されました。結果として、プラスミドDNAは一般的な細胞やトランスフェクションが困難な細胞でのトランスフェクションに成功し、最も厳しいアプリケーションに直接使用できました。

トランスフェクションの結果は、レポータージーンであるホタルルシフェラーゼの発現で示されました（表2）。Genopureによるトランスフェクショ ン効率は、コトランスフェクションされたコントロールのウミシイタケのルシフェラーゼに関しても概して良好（高くない場合でも）でした（図2）。

表2. 従来のキットとGenopureプラスミドマキシキットを使用して調製されプラスミドpBCL-2とpRP16での、ホタルルシフェラーゼの発現を促すプロモーターの活性測定。プラスミドはFuGENE 6を用いてトランスフェクションされました。

プラスミド	細胞株	ホタルルシフェラーゼのライトユニット
		従来法キット	Genopure
pBCL-2	A549	307.44± 22.81	257.47± 18.53
	Calu-3	999.21±126.41	946.41± 37.75
pRP16	R623	568.86± 76.41	494.92± 4.2
	1149	101.91± 12.12	182.40±70.42

図2：コトランスフェクションされたウミシイタケのルシフェラーゼ活性で較正されたホタルルシフェラーゼ活性。 従来法のキットとGenopureキットで調製されたプラスミドにより得られた比率をそれぞれ並べています。平均値±標準偏差は、2回のトランスフェクションより導いています。

われわれの比較データはGenoPureプラスミド マキシキットにより、従来法よりも高純度なプラスミドDNAが得られることを示しました。第1に、中和バクテリア溶解液を清澄化する単純なろ過ステップ は、フィルターカートリッジ（あるいは遠心）を取り扱うよりも簡便です。第2に、Genopureキットでは、クロマトグラフィー法では必要な洗浄や溶出 ステップが少ないため、30%の時間短縮となります。結論として、このキットは最も厳しい分子生物学のアプリケーションに適する、高純度プラスミドの分離 における優れた代替品ということができます。

著者：Sebastian Bredow
Molecular Biology and Lung Cancer Program, Lovelace Respiratory Research Institute, Albuquerque, USA

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関連製品名	製品番号	包装単位	希望価格
FuGENE 6 トランスフェクション試薬	1815091	0.4 ml	¥27,800
	1814443	1 ml	¥58,700
	1988387	5×1 ml	¥234,800

BIOCHEMICA2004NUMBER4(No97)