MagNA Pureコンパクトシステム - 血清・血漿サンプルからのウイルス核酸精製による性能評価

ライトサイクラー コーナー

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
MagNA Pureコンパクトシステム	3731146	1台	ご照会
MagNA Pureコンパクト核酸 アイソレーションキットI	3730964	1キット(32回)	¥25,000
MagNA Pureコンパクト核酸 アイソレーションキットI-大容量	3730972	1キット(32回)	¥50,000
MagNA Pureコンパクト チップトレイキット	3730166	1キット (10チップトレイ)	ご照会

はじめに

新しく開発されたMagNA Pureコンパクトシステムは、核酸精製の完全自動化により、一度に最大8サンプルを迅速に処理することができます。ソフトウェアのガイドによるセット アップと、プレパック試薬カートリッジの採用により、操作にかかる手間と時間が大幅に縮小されています。精製はMagNA Pure LCでも採用されている、信頼性の高い磁性体粒子分離技術をベースとしています。

MagNA Pureコンパクトシステムのプロセス、原理、アプリケーション、そして血液（全血）と培養細胞を用いた性能データは、2003年のBIOCHEMICA No.4で既に述べられています。ここではウイルスDNA／RNAをスパイクした血清および血漿サンプルを用いた性能データを紹介します。この試験では、 溶出液の安定性、再現性、スケール、感度、直線性の項目を他法と比較して評価しています。

材料と方法

サンプル

核酸精製の前に、血清および血漿（クエン酸、EDTA）のプールに、パルボウイルスB19とA型肝炎ウイルス（HAV）の希釈系列［最終濃度：10²～10⁵ウイルス粒子/ml（vp/ml）］をスパイクしました。

MagNA Pureコンパクトシステムによる核酸の分離

MagNA Pureコンパクト用キット（核酸抽出キットIまたは核酸抽出キット-大容量）の試薬カートリッジをバーコードスキャナーで読み取り、機器のカートリッジ ラックに装着します。次にキットのチップトレイとバーコード付の溶出チューブを各位置にセットします。血清または血漿(100～1,000μl)をサンプ ルチューブに直接移し、チューブラックにセットします。ソフトウェア上で適切なプロトコール、サンプルの種類、溶出液量を選択し、全自動の核酸精製をス タートします。機器は全自動で総ての精製ステップを行います。溶出液は分析まで-20℃で保存しました。

MagNA Pure LCによる核酸の精製

精製は、トータル核酸抽出キットIまたはトータル核酸抽出キットI- 大容量のプロトコールに従い行いました。溶出液は解析まで-20℃で保存しました。

精製された核酸の定量分析

精製された核酸はライトサイクラーとそのキットである「パルボウイルスB19定量キット」または「HAV定量キット」を用い、定量しました。

溶出液中の核酸の安定性

血漿から精製処理した溶出液は小分けし、20℃、4℃、-20℃、-80℃で4～16時間保存しました。溶出液中のRNAの安定性は、ライトサイクラーによるHAVの定量PCRで評価しました。

結果

機器の操作

短時間のトレーニングで、未経験者でも安全に操作できるようになります。一連のセットアップ操作を通じて、ソフトウェアがガイドします。バーコードス キャナーを使用することで、サンプルとカートリッジのローディングのスピードアップ、同時にサンプルの追跡が可能となっています。8サンプル分のセット アップに要する時間は約10分間、精製処理時間は約25分間です。

感度と直線性

血漿(クエン酸とEDTA) に、パルボウイルスB 19(DNAウイルス)とHAV(RNAウイルス)の希釈系列［最終濃度：10²～10⁵vp/ml］をスパイクしました。その血清1,000μlと血漿500μlより核酸を抽出しました。50μlの溶出液のうち5μlをライトサイクラーでの PCRやRT-PCR分析に使用しました。図1はHAVの結果を示しています。溶出液中に100%回収されていると仮定すれば、血清のPCRでは10コ ピーまで、血漿では2～3コピーが検出されており、優れた感度と直線性が示されました。より少ないサンプル容量からの精製でも、PCRで1コピーが検出さ れました（データ不掲載）。

図1：HAV（範囲は102vp/mlから105vp/ml）をスパイクした血清と血漿(クエン酸、EDTA)を処理し、ライトサイクラーを使用したHAV特異的PCRで分析した。

他法との比較

スパイクした血清と血漿サンプルを小分けし、MagNA Pure LCでも同時に核酸を精製しました。核酸の精製には、1,000μlのサンプルを使用しました。100μlの溶出液のうち5μlをライトサイクラーでの分 析に使用しました。図2は、クエン酸血漿でのHAVの結果を示しています。HAVでは、両者でほぼ近いライトサイクラーのクロッシングポイント（Cp値） を示しています。パルボウイルスB 19では、MagNA Pureコンパクトシステムの方が、若干良い結果を示しました。

図2：それぞれのウイルス（HAVとパルボウイルスB 19の範囲は102vp/mlから105vp/ml）をスパイクしたクエン酸血漿を処理することで、2つの機器の性能を比較。

溶出液の安定性

純度の低い核酸精製や精製過程におけるコンタミネーションにより、ヌクレアーゼによる問題が生じ、分析の障害となります。MagNA Pureコンパクトシステムで溶出液中にヌクレアーゼが含まれないことをテストするため、血漿サンプルにHAVをスパイクしました。精製後、溶出液を小分 けし、さまざまな温度で4～16時間インキュベートしました。ライトサイクラーによるRT-PCRでのHAV定量の結果、20℃で16時間と-80℃で 16時間のインキュベーションの間で、顕著な違いは見られませんでした(データ不掲載)。これは溶出された核酸が高純度であることを示しています。

結論

MagNA Pureコンパクトシステムは、比較的少数のサンプルを扱う研究室で全自動核酸精製できるようにデザインされており、1バッチ最大8サンプルを処理するこ とができます。プレパック試薬カートリッジを使用するため、セットアップを迅速かつ簡単です。現在、2種類のキット（サンプル容量100～400μl用、 500～1,000μl用）があります。サンプル材料としては、全血、培養細胞、そしてここで示したように血漿と血清も対象となっています。

精製の性能はMagNA Pure LCシステムと同等で、優れた直線性、ウイルス滴定およびサンプル容量についてのスケール性、および感度を示しています。

著者：Harald Walterberger
MicroCoat Biotechnology GmbH, Bernried, Germany

詳細はインターネットスペシャルサイトで：
http://www.roche-applied-science.com/sis/magnapure/

BIOCHEMICA2004NUMBER3(No96)