-mRNAキャプチャーキット- cDNA-AFLPにおけるその応用

ジーンデテクション コーナー

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
mRNAキャプチャーキット	1787896	1キット （192回反応）	¥49,000

特長

mRNAキャプチャーキットは簡単迅速な1チューブ反応で、poly(A⁺)RNAの分離とRT-PCRを組み合わせることの出来るキットです。多くのサンプルを、より簡単に取り扱えるようにデザインされています。

キット内容

1. 溶解バッファー	50 ml
2. ビオチン標識オリゴ(dT)20	50μl
3. ヌクレアーゼフリー再蒸留水	1 ml
4. 洗浄バッファー	5×100 ml
5. ストレプトアビジンコートPCRチューブ(ストリップ)	24×8
6. CRチューブ用キャップ(ストリップ)	24×8

はじめに

1996年に発表されて以来、cDNA-AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）は植物系と動物系の両方で、さまざまなゲノムにわたる遺伝子発現研究で好まれるツールとなりました。cDNA-AFLPは、 DNA配列に対する既知情報が無くても使用できる、高感度で再現性の高い技術であるため、配列決定されていないゲノムの遺伝子発現分析に好んで使用されま す。cDNA-AFLP法は以下のステップより構成されます：

• mRNAからcDNAへの変換
• レアカット（BstMなどの6塩基認識）および通常の制限酵素（MseIなどの4塩基認識）を使用してのcDNAの切断（図1）
• アダプターのライゲーション
• アダプター特異的プライマーを使用しての連結フラグメントのプレ増幅
• 各プライマー上の選択的ヌクレオチドに相補的なアダプター特異的プライマーを使用しての小断片プールの増幅

ほとんどのcDNA-AFLPプロトコールはBachemらの発表に基づいており、切断ステップでビオチン化cDNAを固相化するために、ストレプトア ビジンコート磁性体粒子の使用が記述されています。ここでは、ロシュ・ダイアグノスティックスのmRNAキャプチャーキットを使用した方法（ワンチューブ 法）で、ストレプトアビジンコート磁性体粒子の代わりにストレプトアビジンコートPCRチューブを使用する利点について述べます。mRNAの逆転写と cDNAの切断は、洗浄などの時間のかかるステップを排除して、効率的に1チューブ内で行うことが出来ます（図1）。それに加え、全てのインキュベーショ ンステップがサーマルサイクラー内で行えます。

図1：遺伝子特異的cDNAフラグメントを得るための通常のcDNA-AFLP操作法の第一のステップ。 (a) 二重鎖(ds)DNAを200μlのPCRチューブ内で合成する。 (b) 得られたcDNAはカラムを使用して精製し、定量する。小分けしたcDNAを制限酵素で切断する。 (c) 最後にcDNAの3'末端がストレプトアビジンコート磁性体粒子(赤)で捕捉され、洗浄と捕捉が数回のステップで行われる。最新の1ステップ法では、全てのステップが1本のストレプトアビジンコートPCRチューブ内で行われる。

ここでは、トマトの胚珠と子房壁の発達におけるギベレル酸(GA₃)処理や受粉の効果を研究しました。

材料と方法

トータルRNAは未処理子房の胚珠と子房壁、GA₃処理後の子房、および受粉後1、2、3日目の植物の子房から、RNAアイソ レーションキットを使用して分離しました。10μlの脱ミネラル化RNaseフリー水中の5μgのトータルRNAを、40μlの溶解バッファーおよび 0.05μlのビオチン化オリゴdT（キット内に添付）と混合しました。このミックスをストレプトアビジンコートPCRチューブ（キット内）に移し、サー マルサイクラー中で37℃、5分間インキュベートしました。次に室温に戻し、氷上に静置します。このステップで、mRNAのポリAテイルが、ビオチン化オ リゴdTとハイブリダイズし、ストレプトアビジンコートPCRチューブの壁面にビオチン分子が結合します。液体を捨て、結合mRNAを100μlの洗浄 バッファー（キット内）で2回洗浄しました。

逆転写は、50μlの第一鎖cDNA合成ミックス［31.3μlの水、10μlの5x第一鎖バッファー、5μlの0.1 M DTT、2.5μlの10 mM dNTPs、1.2μlのRNase H-リバーストランスクリプターゼ(200ユニット/μl)］を加えることで開始し、この反応ミックスを42℃で2時間インキュベートしました。その後、 チューブを氷上に静置し、10μlの反応液を捨て、全量を40μlとしました。87μlの脱ミネラル水、16μlの10x E. coliリガーゼバッファー、6μlの0.1 M DTT、3μlの10 mM dNTPs、1.5μlのE. coliリガーゼ、4.25μl（5ユニット）のE. coliDNAポリメラーゼI、1.6μlのRNase Hを含む混合液を加え、サーマルサイクラー中、12℃で1時間インキュベートし、その後22℃で1時間インキュベートしました。インキュベーションの後、 反応溶液を捨てますが、二重鎖cDNAはチューブの壁面に付着しています。cDNAを200μlの洗浄バッファー（キット内）で、室温で2－5分間イン キュベートし、その後に溶液を捨てることで、3回洗浄しました。最初のcDNA消化は、38.8μlの水、10μlの5x制限-ライゲーションバッ ファー（50 mM Tris-HAc pH 7.5、50 mM MgAc₂、250 mM KAc、25 mM DTT）と1.2μlのBstYI（10ユニット/μl）を加えることで開始しました。60℃、2時間のインキュベーション後、チューブを100μlの洗 浄バッファーで3回洗浄しました。第二の消化は38.8μlの水、10μlの5x制限-ライゲーションバッファー、1.2μlのMse I（10ユニット/μl）を加えることで開始し、37℃で2時間インキュベーションしました。

結果と考察

遊離したBstYI-MseIフラグメントは、Breyneの方法に従ってcDNA-AFLPの次のステップで使用され ました。図2aは1チューブ法で分離されたcDNA断片のプレ増幅後のcDNA濃度を示し、さまざまなRNAサンプルで行われた9つの反応が同一のレンジ であることを示しています。さらに、選択的増幅後、アクリルアミドゲル上に展開された遺伝子の発現パターン（図2）は明瞭で、2つの独立した実験間でも再 現性がありました（データ未掲載）。

1チューブ法の利点はさまざまです。PCRチューブの空隙容積が磁性体粒子のものより小さいため、洗浄ステップはより簡単、迅速、効率的になります。 トータルRNAも使用可能ですが、mRNAのみがチューブ壁面に結合し、リボゾーマルRNAとトランスファーRNAは、逆転写反応前に洗い流されます。同 じ理由で、DNase処理による微量のゲノムDNAの除去も必要ありません。ゲルから200個のDNA断片が分離され、トマト発現配列タグ（EST）に対 応する分析が行われ、いずれにもイントロンは含まれていませんでした。ストレプトアビジンコートPCRチューブは、ビオチン化断片の捕捉や、その他のアプ リケーションにも有用で、われわれはトランスポゾンのディスプレイ実験にも使用しています。AFLPにおいて、ゲノムDNAは6塩基および4塩基認識制限 酵素で切断され、生成断片はビオチン化アダプターのライゲーション後、捕捉されます。その後の操作法の詳細は、Van Den Broeckらが記述しています。

図2：トマトmRNA のcDNAからのプレ増幅と選択的増幅。 (a) 非選択的プライマーを用いたcDNAのプレ増幅産物をロードしたアガロースゲルのエチジゥムブロマイド染色。100 bpラダーマーカーを両側にロードしている。 (b) それぞれ選択的な2種類のヌクレオチドを持つプライマーを使用したcDNAフラグメントの増幅後の結果を示している。矢印は、受粉後2、3日目の子房と、 ギベレル酸(GA3)処理により心皮壁で誘導されたmRNAレベルの遺伝子フラグメント(340 bp)を示している。

文献

1. Bachem CWB et al. (1996) Plant J 9:745-753
2. Breyne PR et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:14825-14830
3. Vos P et al. (1995) Nucleic Acid Res 23:4407-44114
4. Van Den Broeck D (1998) Plant J 13:121-129

著者：Richard Feron
Department of Experimental Botany, University of Nijmegen, Nijmegen, The Netherlands

BIOCHEMICA2004NUMBER3(No96)