-FuGENE 6- ショートヘアピンRNA導入による哺乳細胞でのジーンサイレンシング

Cell Biologyコーナー

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
FuGENE 6	1815091	0.4 ml	¥ 27,800
	1814443	1 ml	¥ 58,700
	1988387 （旧製品番号：1815075）	5×1 ml	¥234,800

特長：

真核細胞のトランスフェクション用ノン－リポソーマル試薬

• より迅速なプロトコール： FuGENE 6を希釈、DNAを混合し、直接細胞に加えるだけ。
• 血清の存在下で、トランスフェクション前、後の培地交換が不要（ハイスループット アプリケーションに最適）。
• 細胞の生存率が高まる事で、高レベルのタンパク質発現が得られる（他の繁用されるトランスフェクション試薬と比べ、細胞へのアポトーシスを誘導しない）。

図1：牛胎児血清の存在／不在下でのFuGENE 6のトランスフェクション効果の比較。 CHO-1細胞にFuGENE 6量を変えて血清の存在下（10%）、不在下でp-CMV β-GalプラスミドDNA（ウェル当たり2μg）をトランスフェクションした。トランスフェクションの27時間後に細胞を溶解、採取した。5μlの溶解 液をβ-Galレポータージーンアッセイ、化学発光キット（Cat. No. 1758241）で、分析した。

アプリケーション：

大きなプラスミド（12 kb）やオリゴヌクレオチド、核酸などのDNAでの、初代培養やトランスフェクトが困難な真核細胞種のトランスフェクション。FuGENE 6で成功している数百種以上の細胞のリストはウェブサイト、http://www.roche-applied-science.com/sis/fugene/をご覧ください。

はじめに

RNA干渉（RNAi）は初め、線虫や植物で明らかになった生物的現象で、強力な遺伝学的ツールとして、これらの系で急速に利用されてきました。今で は、二本鎖RNA（dsRNA）が誘導するサイレンシング現象が、植物、真菌、昆虫、原生動物、後生動物を含むすべての生物に存在することが明らかになっ てきました。短い干渉RNAs（siRNA）、あるいは短いヘアピンRNA（shRNA） を哺乳類の系で使用して、おそらくヒトやマウスのゲノムにおけるいかなる遺伝子でもdsRNAジーンサイレンシングのターゲットとなるという観点に到達し ています。それゆえ、RNAiは急速に、哺乳細胞系での標準的なテクニックに成長しました。

哺乳細胞中でのsiRNAのトリガーとなる、内在的に発現しているヘアピンRNAと類似の、in vitro発現コンストラクトが、数多く開発されてきました。われわれのアプローチは、DICERによって処理され、RNAiパスウェイに組み込まれるshRNAを 作成するために、U6 RNAポリメラーゼIIIプロモーターから発現された、短い転化リピート（21-29ヌクレオチド）を使用しています。ほとんどの哺乳細胞株での、 shRNA発現コンストラクションを持ったプラスミドのトランジェントなトランスフェクションは、ジーンサイレンシングを引き起こすのに十分です。興味深 いことに、さまざまなターゲッティング効率を持つshRNAsを採用した、shRNAはジーンノックダウンの“epi-allelic”シリーズの作成に 使用することができます。

さまざまなファクターがノックダウン効率に影響し、それには、ターゲットの配列特性やトランスフェクション効率、ターゲットmRNAやタンパク質の量や 安定性などが含まれます。shRNAの発現のためには、ターゲット遺伝子あたり3-6個のヘアピンを試験することが推奨されます。ほとんどの場合、少なく ともひとつのshRNAが90%以上のノックダウンを行うべきです。しかしながら、対象の生物学実験を行う前に、shRNAに特異的なジーンサイレンシン グであることを評価することが強く推奨されます（ウェスタンブロット、免疫蛍光法、RT-PCRなど）。至適でないトランスフェクション効率の細胞には、 多数回のトランスフェクションが、ノックダウン効率を最大限にするために行われます。一回のトランスフェクションでは、ジーンノックダウンアッセイは、ト ランスフェクション後48時間から98時間の間に行うことが出来ます。
ここでは、FuGENE 6トランスフェクション試薬を使用しての、NIH/3T3細胞における遺伝子のトランジェントなノックダウンに対する、簡便なプロトコールを記述します。

材料と方法

細胞培養

NIH 3T3細胞を10%のFCS添加によるDMEM培地で培養しました。

shRNAベクターの調製

PML、p53、Tyro29ntのshRNAがU6発現ベクターにクローニングされました。

トランスフェクション

1×10⁵個/ウェルの細胞を6ウェルプレートにウェルあたり2 mlの培地中に播種しました。トランスフェクションは播種の次の日に行いました。

トランスフェクション複合体の形成のために、無血清のDMEMで希釈したFuGENE 6を、3:1の割合で、500 ngのshRNAベクターと混合しました。混合物は15分間インキュベートされました。

細胞は、500 ngのshRNA発現ベクター（PML－特異的shRNA発現プラスミド、p53とTyro29ntコントロールベクター）を含む、100μlのトランス フェクション複合体を各ウェルに加え、トランスフェクションされました。培地はトランスフェクションの16時間後に交換されました。

トータルのタンパク質がトランスフェクションの48時間後に、プロテアーゼインヒビター（コンプリート、Roche）とdeSUMOlaseインヒビ ター（2-ヨードアセトアミド、Calbiochem；N-エチルマレイミド、Sigma）を添加した 細胞溶解バッファー（0.2% NP-40、600 mM KCl、50 mM Hepes、0.2 mM EDTA、0.2 mM EGTA、10% グリセロール）を使用して抽出されました。

ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティングにおいて、8%のポリアクリルアミドゲル上のレーン毎に250μgのトータルタンパク質をロードしました。電気泳動の後、タン パク質をニトロセルロースにブロットしました。ブロットはトリス＋Tween＋ブロッキングバッファー（5%ノンファットドライミルク、0.05% Tween ）で、23℃で1時間インキュベートされました。PMLはTMST中に250倍希釈されたモノクローナル抗体（mAb37、CSHL）により、23℃で1 時間インキュベートされました。洗浄バッファー（TBST：15分間を3回）で洗浄の後、ブロットは二次抗体（HRP標識抗マウスIgG抗体、 Update）とインキュベートされました。基質（Lumi-Lightウェスタンブロッティング基質）のインキュベーション後、X線フィルムへの露光に よりシグナルを可視化しました。

結果

U6発現ベクターにクローニングされた30 bpまでの短いヘアピンRNAは、哺乳細胞において配列特異的なサイレンシングを誘導しました。図2は、FuGENE 6でshRNA発現プラスミドを導入したNIH 3T3細胞での、48時間後のPMLノックダウンを示しています。PML特異的shRNAがトランスフェクトされた細胞で、強いノックダウンが見られるの に対し、p53やTyro20nt-特異的shRNAをコードしたプラスミドでは、PMLの発現に影響は見られません。

図2：PML－特異的shRNA発現プラスミド、p53とTyro29nt特異的shRNAコントロールベクターをトランスフェクトされたNIH 3T3細胞から分離されたトータルタンパク質のウェスタンブロット。

結論

哺乳細胞でのトランジェントなジーンサイレンシングに対するshRNAの使用は、現在のジーンノックダウンの技術の幅を拡張し、細胞や疾患関連過程に対 する情報を得ることを可能にしました。FuGENE 6トランスフェクション試薬は哺乳細胞におけるベクターをベースとするジーンサイレンシングに適することが示されました。

この記事の著者：Patrick Paddison and Greg Hannon
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
コンプリート	1697498	20錠	¥35,000
	1836145	3×20錠	¥94,500
コンプリート、ミニ	1836153	25錠	¥18,500
コンプリート、EDTAフリー	1873580	20錠	¥35,000
コンプリート、ミニ、EDTAフリー	1836170	25錠	¥18,500
Lumi-Lightウェスタンブロッティング基質	2015196	100 ml （1000 cm2メンブレン）	¥49,400

トランスフェクション試薬、FuGENE 6がますます使いやすくなりました

新しい包装により4℃保存が可能となりました

ノンリポソーマルトランスフェクション試薬であるFuGENE 6の容器が、プラスチックよりガラスバイアルに変更になります。これにより、製品中のエタノールの蒸発が避けられるため、4℃での保存が可能になりまし た。冷凍の必要がないため、より簡便にFuGENE 6がお使いいただけます。

性能は変わりません

製品の性能および安定性、有効期限はこの変更には影響されません。事故により、研究室の机の上に室温で一週間放置されたとしても、蒸発を防ぐためのふたがしっかり閉まっていれば、その機能に変わりはありません。
ガラスバイアルに変更したことにより、より広い温度域で安定となりました。また、その機能は従来と変わりません。

BIOCHEMICA2004NUMBER2(No95)