cDNAの効率的で信頼性のある直鎖的増幅

Tips & Facts

マイクロアレイキットを使用しての遺伝子発現プロファイリング

遺伝子発現のプロファイリングの使用、多くの遺伝子のmRNA転写レベルを同時並行的に測定する事は、この数年で急激に成長しました。ハイブリダイゼー ションとイメージングのための実際のマイクロアレイと機器以外にも、ターゲットの調製は遺伝子発現プロファイリングの信頼性と感度における主要な重要点で す。開始材料の量と大きく相関する数種類のターゲット調製戦略が最近開発され、入手可能となりました。

ターゲット調製のワークフロー

特に、医学研究アプリケーションにおいて、サンプル試料はしばしば量が限られるため、ターゲットの増幅は必須です。数μgのトータルRNAから出発し、 標識ターゲットを調製するためにT7 RNAポリメラーゼを利用する直鎖的増幅は、最初にvan GelderとEberwineにより記述されましたが、現在ではスタンダードな方法になっています（図1a）。このプロトコールは、第一及び第二鎖の cDNA合成の後に、T7 RNAポリメラーゼを使用してcRNAをin vitro 転写します。第一鎖cDNA合成には、T7プロモー ターシークェンスに連結したoligo（dT）プライマーを使用します。次のステップで、このT7リンカーがT7 RNAポリメラーゼでの、テンプレートの直鎖的増幅と標識ヌクレオチドの取込みを可能にし、一本鎖の標識cRNAが作成されます。この完全なターゲット調 製ワークフローは、ターゲットの品質と完全性を測定するための複数の酵素的ステップより構成されます。

ロシュ・ダイアグノスティックスのマイクロアレイキットの利点

• 標識cRNAの高い収量と完全性
• 遺伝子発現解析のための、少量のRNAを代表（表象）する増幅
• cDNA合成からcRNA標識への継ぎ目の無いワークフロー
• 迅速で簡単な操作法
• ハプテン及び蛍光標識ヌクレオチドの取込み
• 1種類の標識ヌクレオチドしか必要でない
• スポットされた、あるいはin situ合成マイクロアレイとコンパチ

実験的検証

T7 RNAポリメラーゼに基づくターゲット合成法を検証するために、ロシュ・ダイアグノスティックス（RAS）のマイクロアレイRNAターゲット合成キット （T7）と他社（A）のキットを、3種類のヒト急性骨髄性白血病（AML）と1種類の慢性リンパ球白血病（CLL）の研究サンプルを使用して、テストしま した（図1b）。

RNAの分離	トータルRNA	トータルRNA
	↓	↓
cDNA合成	マイクロアレイcDNA合成キット
	ds cDNA	ds cDNA
cDNAの精製	マイクロアレイ ターゲット精製キット	A社に従った ds cDNAの精製
	精製ds cDNA	精製ds cDNA
cRNA in vitro転写と標識	マイクロアレイRNA ターゲット合成キット（T7） ビオチン - UTPによる標識	A社のキットを使用しての T7 in vitro 転写と ビオチン - UTPと CTPの標識
	標識cRNA	標識cRNA
cRNA精製	マイクロアレイ ターゲット精製キット	A社に従った 標識cRNAの精製
	精製標識cRNA	精製標識cRNA
アレイハイブリダイゼーション	HG - U113A Gene Chipアレイとの ハイブリダイゼーション	HG - U113A Gene Chipアレイとの ハイブリダイゼーション

図1：a)Eberwine法に従ったcRNA増幅の一般的なワークフロー；b) 検証実験のセットアップ。
cDNA 合成は、ロシュ・ダイアグノスティックスのマイクロアレイcDNA合成キットと各5μgのトータルRNAを使用して、すべてのサンプル（2 x 3種のヒト急性骨髄性白血病［AML］サブタイプ、2 x 1種類の慢性リンパ球白血病［CLL］）で独立して行われた。得られたds cDNAは、マイクロアレイターゲット精製キット及び、A社の推奨する方法に従って精製された。その次のcRNA in vitro 転写 ／ビオチン - UTP標識と精製は、1グループのサンプルでは、マイクロアレイRNAターゲット合成キット（T7）とマイクロアレイターゲット精製キットで行った。他の グループでは、A社のキットを使用して、ビオチン - UTPとビオチン - CTP標識cRNAを作成した；次のcRNA精製はA社の推奨する方法に従って行った。10μgの標識cRNAを、アフィメトリックスのHG - U113A GeneChipアレイとハイブリダイズした。

最初に、RASのマイクロアレイcDNA合成キットで5μgのトータルRNAを二本鎖（ds）DNAに変換しました（8回の反応）。ds cDNAサンプルの1つのグループをRAS マイクロアレイターゲット精製キットで精製し、T7 RNAポリメラーゼで増幅し、RAS マイクロアレイRNAターゲット合成キット（T7）を使用して、ビオチン - UTPで標識しました。そして、標識cRNAをRASマイクロアレイターゲット精製キットで精製しました。もう一方のサンプルグループのds cDNAは、A社のプロトコールに従い精製した後、A社のキットでin vitro 転写とビオチン- UTPとビオチン- CTP標識を行いました。標識cRNAの精製は、A社の推奨に従い行いました。すべてのサンプルにおいて、10μgの標識cRNAをHG - U113A GeneChipアレイとハイブリダイズしました。

T7増幅の性能を推定するために、ビオチン標識cRNAの収量とHG - U113A GeneChipアレイから得られたハイブリダイゼーション結果を解析しました（表1）。

表1：HG - U113A GeneChipアレイと標識cRNAのハイブリダイゼーションから得られた発現アレイデータの比較。標識cRNAは、RASマイクロアレイキットとビオチン - UTP、あるいはT7 in vitro 転写/ビオチン - UTPとビオチン - CTP標識とA社の推奨するcRNA精製法を使用して様々な白血病サンプルから作成された。

	マイクロアレイキット （反応液20μl、2時間）			A社の推奨する方法 （反応液40μl、4時間）
	cRNA収量 （μg）	GAPDH 3’- 5比	判定（％）	cRNA収量 （μg）	GAPDH 3’- 5比	判定（％）
AML 1	40	1.5	49.2	44	2.8	46.5
AML 2	43	1.2	53.6	50	1.4	48.5
AML 3	43	3.7	39.3	46	4.5	35.5
CLL	39	2.2	48.7	30	3.0	43.2

高い効率を持つ迅速な方法

標識cRNAの収量は、4種類のサンプルの内3つにおいて、RASマイクロアレイキットの方がわずかに低下しました。しかしながら、反応液量（20μl vs. 40μl）と反応時間（2時間 vs. 4時間）は、RASマイクロアレイRNAターゲット合成キット（T7）は、A社のアプローチに比べ、両方とも半分に減少しており、キットの高い効率と速い 操作法を示しています。それに加え、RASマイクロアレイターゲット精製キットは、EberwineのプロトコールにおけるcDNA/cRNA精製ステッ プを単純化しています。

HG - U113A GeneChipアレイから得られたハイブリダイゼーションデータは、RASマイクロアレイRNAターゲット合成キット（T7）で作成された標識cRNA において、より高い判定を示しており、より高い感度を表しています。キットのプロトコールは、たった1種類の標識ヌクレオチド（ビオチン- UTP）を取込ませるように、経済的に至適化され我々の結果は、更なる標識ヌクレオチドの添加は、これ以上の感度の改善をもたらさない事を示唆していま す。

さらに、グリセロアルデヒド- 3 -リン酸脱水素酵素（GAPDH）の3’- 5’レシオは、これらターゲットの低い比率を表し、直鎖的増幅と標識にRASマイクロアレイRNAターゲット合成キット（T7）を使用した時、完全長 cRNAターゲットのより多い収量と完全性が達成された事を示唆しています。

RASマイクロアレイターゲットの使用は、標識ターゲットcRNAの更なる完全性と結果となり、より効率的なターゲット調製法である事を示しています。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
マイクロアレイキットはEberwine法を完全にサポートしています：
マイクロアレイcDNA 合成キット	3315622	25回反応	←製品番号をクリック
マイクロアレイRNAターゲット 合成キット(T7)	3266877	25回反応	←製品番号をクリック
マイクロアレイターゲット 精製キット	3266885	50回精製	←製品番号をクリック
サンプル試料が限られる(微少生検やマイクロダイセクションされた組織サンプルなど)場合、マイクロアレイ ターゲット増幅キットにより、50 ngのトータルRNAから、ds cDNAが合成できます。
マイクロアレイ ターゲット 増幅キット	3310191	10回反応	←製品番号をクリック

BIOCHEMICA2003NUMBER4(No93)