プラスミドスタンダードカーブをインポートしての定量リアルタイムPCR

ライトサイクラー コーナー

ライトサイクラーソフトウェア Ver. 3.5の新しい特徴は、単一パラメーター依存的なプラスミドスタンダードカーブの構築と、未知サンプルを定量するための様々なPCRランへのインポートを を可能にする事です。正確で再現性の高い定量が、様々なランからの測定結果を使用した時にも、達成される事が示唆されます。

はじめに

リアルタイムPCRが1993年に初めて記述されて以来、この方法は特異的なmRNAターゲットの定量（定量RT - PCR）に使用される事が増えてきました。例えば、サイトカイン遺伝子発現は、免疫が介在する疾患の機構を解明するためのツールとして重要です。IL - 4、IL - 4R、IFN - γ、IFN - β、内部リファレンスとして働くハウスキーピングジーンである、ポルフォビリノーゲン デアミナーゼ（PBGD）のmRNA発現を定量するために、ライトサイクラーシステムと配列特異的ハイブリダイゼーションプローブ検出フォーマットを使用 しての、定量2ステップRT - PCRアッセイが開発されました。特異的cDNAターゲットの定量は、外部スタンダード（パラメーター特異的プラスミドスタンダード）と、相関法 （PBGDに相関）を組み合わせた操作法を使用して行われました。スタンダードカーブは、ターゲットとPBGDの絶対コピー数を測定するために使用されま した。新しいライトサイクラーソフトウェア Ver. 3.5を使用する事によって、すべてのランにおいてスタンダードカーブを作成する必要が無い事が示されました。この特別機能は、パラメータ依存的プラスミ ドスタンダードカーブを、未知サンプルでの異なるPCRランにインポートし、正確で迅速な測定の実行を可能にします。

材料と方法

外部プラスミドスタンダードカーブ

対象の各サイトカインと、ハウスキーピングジーン（PBGDをコード）に対するスタンダードカーブを作成するために、未知コピー数の外部相同DNAスタ ンダードとして、プラスミドを供しました。すべてのプラスミドスタンダードは、GeneExpress（ベルリン、ドイツ）によりクローニングされまし た。スタンダードカーブを作成するために、プラスミドはシリコン処理したチューブ内のMS2 RNA（終濃度は10 ng/μl、ロシュ・ダイアグノスティックス）中に、適切な濃度範囲（通常10⁵ - 10⁰）で、系列希 釈（1：10）されました。各測定パラメータに対する信頼性のあるスタンダードカーブを達成するために、プラスミドは、このスタンダードカーブ域を越えて スタンダード希釈を行い、5重数のPCR増幅を行いました。再現性をチェックするために、スタンダードカーブは数日に渡り繰り返し測定しました。スタン ダードカーブを異なるPCRランにインポートする事で、ターゲットの定量を可能にするために、10³ コピーの希釈物をシリコン処理チューブに小分けし、‐20℃で保存しました。この分注液は、インポートされたスタンダードカーブを評価するための、“10³ 三重測定”（スタンダードを二重と未知サンプル）として使用されました。

定量リアルタイムPCR

DNA増幅とデータ採集は、ライトサイクラーシステムを使用して行いました。すべての反応は、ライトサイクラー ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションプローブキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を使用し、4 mM MgCl₂、0.5μMの各プライマー、0.15μMの各ハイブリダイゼーションプローブで行われました。サイトカインの定量のために、2μlのスタンダード希釈物（“10³ 三重測定”）、あるいは2μlのcDNAを加えました。陰性コントロール（H₂O）は、各ランのクロスコンタミネーションをチェックするために含められました。
　反応は95℃、10分間のプレインキュベーションステップの後、95℃で10秒、60℃で10秒、72℃で15秒を45サイクル（IFN - βは50サイクル）、繰り返しました（温度の上昇率は常に20℃/s）。蛍光は60℃のアニーリング期の終わりで測定されました。生データはソフトウェア Ver.3.5で解析されました。チャンネル2での蛍光値／チャンネル3での蛍光値の比が、クロッシングポイント（CP）値を計算するために使用されまし た。

図1.異なるPCRランにインポートされた構築プラスミドスタンダードカーブは、多重硬化症を病む患者からの研究サンプルのcDNAの定量 に使用された。DNAプラスミドスタンダード（ログレンジはターゲットに依存）の1：10希釈系列（MS2 RNA：10 ng/μl）を45サイクルの五重数でPCR増幅に使用した。カーブは、クロッシングポイント（CP）に対してログで計算された濃度の平均値をプロットす る事で得られた。エラーバーは、標準偏差を表す（100個への希釈物のポイント以外はn = 5）。増幅効率は1.97から2.02の変動（IFN -γ：y = - 3.305x + 38.92、エラー = 0.0546、r = -1.00）。スタンダードカーブの誤差は、ライトサイクラーソフトウェアにより計算された、二乗平均誤差である。回帰係数は全てのケースで‐1.00で あった。（Khne BS, Oschmann P, 2002. Biotechniques 33: 1078ffを改変）

結果とアプリケーション

外部プラスミドスタンダードカーブ

対象の様々なサイトカインとハウスキーピングジーン（PBGD）を定量する際に、適切な相同プラスミドスタンダードを、cDNAとスタンダードが同様の 効率で増幅される事を確認するために、使用しました。プラスミドスタンダードとcDNAの増幅効率の比較は、以前に記述されています。図1は、異なる PCRランにインポートするために使用される、サイトカインIL - 4、IL - 4R、IFN - βとハウスキーピングジーンであるPBGDに対するスタンダードカーブを示しています。IFN - γのスタンダードカーブ（y = ‐3.305x + 38.92、エラー = 0.0546、r = ‐1.00）は、PBGDのものと正確に一致しないため、ここでは表示していません。ライトサイクラーが計算したコピー数の対数値の平均を、CP値の平均 に対してプロットした時、すべてのパラメーターにおいて5桁以上の直線間系が検出されました。

異なるPCRランへの外部スタンダードカーブのインポート

新しいライトサイクラー ソフトウェアVer. 3.5は、構築されたスタンダードカーブを、異なるPCRランにインポートするためのツールです。外部スタンダードカーブを用いて、別ファイルを作成し、 未知のcDNAを定量するための別のランにインポートする事ができます。インポートの前に必要な事は、既知濃度のサンプルをすべてのランに含める事です。 それゆえ、10³スタンダード希釈ポイント（スタンダードとして指定）の二重サンプルと、一個の10³スタンダードサンプル（未知として指定）が使用されます（“10³ 三重測定”）。スタンダードカーブデータが無いランに、スタンダードカーブをインポートした時、傾きは一定を保持し、適切なパラメーター依存的スタンダードカーブと一致します。そして、インポートしたスタンダードカーブは、10³希釈スタンダードの測定CP値に応じて、y軸（CP）に沿ってシフトします。CP値が一定で、インポートされたスタンダードカーブの10³スタンダードの値と一致する事が、非常に重要です。

インポートされたプラスミドスタンダードカーブの再現性

PBGD、IL - 4及びIL - 4Rのスタンダードカーブをインポートした10種類のPCRランを、“10³三重測定”のCP測定値の変動をチェックするために分析しました。10³サンプル（未知と指定）を、インポートされた適切なスタンダードカーブに基づく、未知サンプルの定量の正確性のコントロールとしました。“10³三重測定”は、別個の分注液を異なる日ごとに測定しました。表1に示されるように、3つのパラメーターにおけるCP値の測定間変動係数は、10³スタンダード二重測定と10³未知測定において、1‐2%の間であり、良好な再現性を示しました。それゆえ、“10³三重測定”のCP値が一定であるかぎり、異なるラン中の未知サンプルの定量にインポートされたスタンダードカーブが使用可能でした。

表1. PBGD、IL - 4及びIL - 4Rのインポートされたスタンダードカーブの再現性。
インポートされたスタンダードカーブでの10回の別々のランが以下に示される。“10³三重測定”のCP値（CP STD 10³　1と2：スタンダードサンプルの二重測定、スタンダードと指名：CP 10³ 未知：スタンダードサンプル、未知サンプルと指名）はすべてのランで測定された。変動係数（CV）は、良好な再現性を示している。

パラメーター	ラン	CP STD 103	CP STD 103	CP 103	傾き	Y‐切片
		1	2	未知
PBGD	1	29.99	29.77	29.86	-3.232	39.58
	2	29.56	28.76	29.67	-3.232	38.86
	3	28.83	28.86	29.01	-3.232	38.55
	4	29.34	29.14	28.9	-3.232	38.94
	5	29.43	29.25	29.42	-3.232	39.04
	6	29.44	29.49	28.95	-3.232	39.16
	7	29.05	29.11	29.34	-3.232	38.78
	8	29.21	28.74	29.59	-3.232	38.67
	9	28.55	28.14	28.67	-3.232	38.04
	10	28.65	28.43	28.12	-3.232	38.24
CV（%）		1.44	1.59	1.71	0.00	1.09
IL - 4	1	25.9	26.13	26.28	-3.268	35.82
	2	25.62	25.46	25.82	-3.268	35.35
	3	25.64	25.45	25.45	-3.268	35.35
	4	25.93	25.61	25.51	-3.268	35.57
	5	25.8	25.71	25.85	-3.268	35.56
	6	26.12	26.44	26.18	-3.268	35.97
	7	26.62	26.54	26.09	-3.268	36.38
	8	25.99	26.01	26.45	-3.268	35.8
	9	25.83	25.97	25.86	-3.268	35.7
	10	26.09	26.31	26.15	-3.268	36
CV（%）		1.05	1.45	1.19	0.00	0.84
IL - 4R	1	27.27	27.84	27.51	-3.399	37.75
	2	27.89	27.87	27.53	-3.399	38.08
	3	27.01	27.11	27.45	-3.399	37.26
	4	28.1	27.55	27.64	-3.399	38.03
	5	27.01	27.93	27.79	-3.399	37.67
	6	26.46	26.66	27.15	-3.399	36.76
	7	26.8	26.7	26.84	-3.399	36.95
	8	26.59	27.14	27.03	-3.399	37.07
	9	26.83	26.82	27.01	-3.399	37.02
	10	26.64	26.69	26.56	-3.399	36.86
CV（%）		1.92	1.82	1.37	0.00	1.26

まとめ

各ライトサイクラーのラン毎に、スタンダードカーブを引く必要の無い事が示されました。このステップを除く事は、mRNAの正確で再現性のある定量に、大変簡便で迅速な方法を提供します。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
ライトサイクラー ファストスタートDNAマスター ハイブリダイゼーションプローブ	3003248	96回反応	←製品番号をクリック
	2239272	480回反応	←製品番号をクリック
ライトサイクラー ソフトウェア Ver.3.5	1909304	1パック	←製品番号をクリック
ライトサイクラー インスツルメント	2011468	1台	ご照会
RNA､MS2	165948	500μl	←製品番号をクリック

★ソフトウェアはキャンペーン価格です。

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BIOCHEMICA2003NUMBER3(No92)