画期的なタンパク質発現システムであるRTS（Rapid Translation System）は、進化を続けます。 タンパク質の酵素的モノビオチン化用－ RTS AviTagビオチン化試薬

RTS（ラピッドトランスレーション システム）コーナー

－タンパク質の変異分析とリガンドスクリーニングを実行するための効率的な手段

はじめに

タンパク質へのビオチン残基の部位特異的導入により、その固相化や精製、検出において、強力なアビジン／ストレプトアビジンテクノロジーが利用できま す。これは、ビオチンプロテインリガーゼ（BPL）により特異的に認識され、ビオチン化される部位を含む、ペプチドタグの導入により達成されます。ATP 依存性プロセスにおいて、BPLは特異的なペプチドタグ内部のリジン残基のε-アミノ基に、ビオチンを転移します。それに対し、化学的なビオチン化反応 は、煩雑な分離方法との組み合せと、通常は部位特異的ではない、対象のタンパク質とビオチン化試薬との化学量論的変動により、モノビオチン化が達成されま す。その上、酵素的アプローチは直接、in vivo およびin vitro タンパク質発現と連動させる事ができます。
この記事では、ラピッドトランスレーションシステムRTSと、E. coli プロテインリガーゼのための人工ビオチン化部位（AviTag, Avidity Inc.）を使用しての、タンパク質のモノビオチン化について記載します。その、SPR相互作用分析への応用についても提示します。

材料と方法

発現ベクター

C - 末端並びにN - 末端にAviTagを導入するためのシークェンスを含む、RTSでの発現ベクターpIVEX 2.7dとpIVEX 2.8dは、古典的なプライマー合成、アニーリング、ライゲーション反応で標準的なpIVEXベクターに挿入され、構築されました。N - 末端AviTagのヌクレオチドシークェンスは、プロテオエキスパートの計算アルゴリズムによりin vitro 発現への至適化がなされました。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の遺伝子が、制限酵素Nco I/Sma Iを用いてマルチプルクローニングサイトに挿入されました。

図1：in vitro タンパク質発現（ラピッドトランスレーションシステムRTS）と酵素による部位特異的ビオチン化（AviTag）のアプリケーションスキーム。

図2：a) RTS 100 E. coli HYキットを使用し、BirA量を増加させながらのpIVEX 2.7 CATのin situ ビオチン化と発現反応。 左：クマシー染色SDSゲル、CATのバンドが示される；右：ビオチン化CATとストレプトアビジンが複合体を形成した後の、DIG標識抗CAT抗体／POD標識抗DIG抗体でのウェスタンブロット検出。 b) RTS 500 E. coli HYキットを使用しての、pIVEX 2.8d WT CATとpIVEX 2.8d CAT（プロテオエキスパートアルゴリズムにより至適化されたコドン）のin situ ビオチン化と発現反応。

in vitro タンパク質発現とビオチン化反応

タンパク質発現はRTS 100 E. coli HYキット（並びにRTS 500 E. coli キット）を使用して行われました。ビオチン化反応は、タンパク質発現の開始点においてBirA、ビオチン、ATPを、その場に加える事で達成されました。

SDS - PAGEとストレプトアビジン ゲルシフトアッセイ／ウェスタンブロッティング

発現タンパク質は、市販のプレキャストSDSゲルとバッファー溶液（NuPAGE/Invitrogen）を使用してSDS - PAGEにより分析されました。分離されたタンパク質は、PVDFメンブレンにブロット（50 V、1.5時間）され、そのメンブレンは0.1% Tween 20を含むリン酸バッファー（PBST）中、5%の低脂肪ミルク（Merck）でブロックされた後、PBSTで3回洗浄されました。DIG標識抗CAT抗 体と、POD標識抗DIG抗体をストレプトアビジン ゲルシフトアッセイに、POD標識ストレプトアビジンをビオチン化タンパク質の検出に、Lumi - Lightウェスタンブロッティング基質と共に使用しました。分析はLumi - Imager/LumiAnalystで行いました。

ストレプトアビジン ゲルシフトアッセイのために、発現混合液を過剰量のストレプトアビジンとインキュベートしました。ストレプトアビジンの結合によるビオチン化CATの分子量の増加は、SDS - PAGEによりモニターされました。

分子間相互作用

抗CAT抗体のAviTag CAT_bioへの結合は、Biocore 3000を使用して、表面プラズモン共鳴（SPR）アングルのレコード変化によりモニターしました。in vitro 発 現ビオチン化CATは、更なる精製をせず、VSメンブレン 0.025μm（Millipore, VSWP 0 1300）を使用して、10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaClに対して短時間透析しました。サンプルを様々な濃度に希釈し、Biocoreストレプトアビジンチップにロードしました。ポリクローナル抗CAT 抗体の結合は、リファレンスとしてhhミオグロビン_bioを使用して測定されました。

結果

CATはC - 末端AviTag発現ベクター（pIVEX 2.7d）にクローニングされました。図2は、BirA濃度に依存した、pIVEX 2.7d由来のC - 末端AviTag CATのビオチン化レベルを表しています。発現とビオチン化反応はRTS 100フォーマット中で2時間行われました。クマシー染色（図2a左）は、トータルCAT発現が一定に保たれている事を示しています。ストレプトアビジン ゲルシフトアッセイのウェスタンブロッティング（図2a右）は、未ビオチン化CATはその分子量の位置にあり、ストレプトアビジンと複合体を形成したビオ チン化CATは、高分子量側にシフトした事を表しています。未ビオチン化CATやビオチンでブロックされたストレプトアビジンによるコントロール実験サン プルでは、分子量は増えていません（データ未掲載）。50μlの反応ミックスに0.5μgのBirAの添加で、ほぼ完全なビオチン化が達成されました。

CATは、野生型AviTagヌクレオチドシークェンス、およびプロテオエキスパートで至適化されたAviTagヌクレオチドシークェンスを含む、N - 末端AviTag発現ベクター（pIVEX 2.8dWTおよびpIVEX 2.8d）中にクローニングされました。サイレントミューテーションのみが許容されました。発現とビオチン化は、RTS 500フォーマット中30℃、24時間で行われました。図2bはRTS 500発現混合液中の総タンパク質のクマシー染色ゲルを示しています。発現CATの総量は、至適化されたAviTagのケースで大きく増加しています。

次の実験は、in vitro 発現およびビオチン化タンパク質が、直接にストレプトアビジンコート済みチップの表面に結合できる事を示 しています。C - 末端AviTag CATは、29μMの濃度のpIVEX 2.7d CATテンプレートからRTS 100フォーマットで発現；完全なビオチン化は、Bir、ビオチン、ATPをin situ で加える事で行われました。発現／ビオチン化 ミックスから過剰のビオチンを除去するために、短時間の透析ステップが必要でした。混合液を100 nM、10 nM、1 nMのビオチン化CAT濃度にSPR分析ランニングバッファーで希釈しました。30 pmol、3 pmol、0.3 pmolのAviTag CAT_bioがSPRチップの3つの分離されたチャンネルにロードされ、質量の増加はそれぞれ、246、121、20共鳴ユニット（RU、図3：棒グラフ）でした。ポリクローナル抗CAT抗体との相互作用が、500 nMで測定されました。抗体は、表面に結合したAviTag CAT_bioと安定な結合を示しています。オフレートとT_1/2分離は3種類の表面で測定され、72分間で1.5 - 1.7 x 10^-4 x 1/sでした。

図3： a)1 nM、10 nM、100 nM溶液からBiacore SAチップに固相化されたAviTag CATbioのSPR分析。 ポリクローナル抗CAT抗体の結合／解離が見られる。 b)1 nM、10 nM、100 nM溶液からのAviTag CATbioのBiacore SAチップへの固相化。

結論

AviTagテクノロジーを採用した、ビオチン残基のタンパク質への部位特異的導入はRTSでのin vitro タンパク質発現と容易 に組み合わされました。タンパク質と、その既知あるいは未知の結合パートナーとの相互作用研究に使用するには、ほんの少量のビオチン化タンパク質しか、 SPRチップをコートするために必要ではありませんでした。タンパク質発現は同時並行－RTS 100 E. coli HYフォーマット中で96発現反応まで－で行えるため、このアプローチはタンパク質のミューテーション分析と、リガンドのスクリーニングに効率的な道を提供しました。

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Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
RTS AviTag E. coli ビオチン化キット、リニアテンプレート	3521818	1キット (96回反応)	¥59,800
RTS AviTag E. coli ビオチン化キット、プラスミド	3514919	96回反応 (RTS 100)、 5回反応 (RTS 500)	¥56,000
RTS AviTag ビオチン化キット	3514935	96回反応 (RTS 100)、 5回反応 (RTS 500)	¥29,800
POD標識ストレプトアビジン	1089153	500 U	¥28,700
Lumi-Light ウェスタンブロッティング基質	2015200	400 ml	¥21,000

BIOCHEMICA2003NUMBER2(No91)