アポトーシス理解における更なるステップ－PARP切断の直接検出

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背景情報

多くの研究が、細胞死調節における異常性が、細胞の増殖（癌など）や細胞の消失（アルツハイマー性痴呆症）に付随して起こる、疾患や病理的状況原因となる事を示唆して以来、アポトーシスの初期イベントの検出は、まったく重要なものとなりました。

アポトーシスパスウェイの主要な開始要因の一つは、カスパーゼの活性化と、それによるカスパーゼ基質の切断です。113-kDa ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ1（PARP-1）は、正常時はDNA修復やDNAの安定化、および他の細胞内のイベントに関与していますが、アポ トーシスの初期にはカスパーゼファミリーにより切断されます。亜鉛依存性真核細胞DNA結合タンパク質であるPARP-1は、様々な遺伝毒性剤により作り 出されるDNA切断を、特異的に認識します。PARP-1の89-kD、あるいは24-kDのカスパーゼ切断フラグメントの検出は、アポトーシスの特質で す。ユビキチン／プロテオソームパスウェイによりアポトーシスの間に分解していく活性型カスパーゼの測定に対して、PARP-1切断の測定は、アポトーシ スの後期ステージにおいても持続するシグナルの検出を可能とします。

製品の記述

PARPカスパーゼ切断産物に対する抗体により、ヒト、マウス、ラット由来の完全長タンパク質ではなく、アポトーシスPARP-1切断の小断片のみを特 異的に検出する事ができます。フルオレセイン標識モノクローナル抗体（クローンPAR-16）は、この初期のアポトーシスマーカーを直接検出できます。

その上、これはカスパーゼ活性にステージにおけるアポトーシスパスウェイ分析（in situ）に対するツールを提供します。これは、フ ローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫組織化学（また抗フルオレセイン抗体と組合わせて）などの様々なアプリケーションで簡単に使用できます。特に、組 織切片に関して、TUNEL法（二重染色のアプリケーションにおいても）を使用して得られた情報を積み上げる事において、この抗体は価値のあるツールとな ります。

典型的な実験例

PARP切断とTUNEL反応性のフローサイトメトリーによる分析

HeLa細胞は抗CD95抗体（クローン2R2, 0.2 mg/ml）とシクロヘキシイミド（10μg/ml）の刺激によりアポトーシスへの移行を誘導されました。5時間後、未処理細胞（図1、左パネル）と CD95刺激細胞（図1、右パネル）をフルオレセイン標識PARPカスパーゼ切断産物に対する抗体（1μg/ml）を使用してPARP切断を染色し、in situ細胞死検出キット、TMR redを使用してTUNEL染色を分析しました。

図1：HeLa細胞におけるCD95誘導アポトーシス：フローサイトメトリーによるPARP切断とTUNEL標識の研究。

ドットブロット分析の、右側2つのボックス内の細胞はPARP-1切断を表示しています；上側の2つのボックスはTUNEL陽性細胞（図1、右パネル） を示しています。PARP切断は、DNAの分解とTUNEL標識に専攻している事に注意してください。HeLa細胞におけるアポトーシスの小さなPARP 断片の染色パターンはまた、免疫蛍光により図2aに表されています。ペプチド競合実験が含まれています（図2b）。完全な概要は、下記のアポトーシススペ シャルインターネットサイトを訪問してください。

• www.roche-applied-sceince.com/apoptosis

図2：フルオレセイン標識PARPカスパーゼ切断産物に対する抗体（緑色の染色）とDAPI（青色の染色）での、アポトーシスHeLa細胞の免疫蛍光標識（a）。 図2bは相当するペプチド競合コントロールを示す。

まとめ

アポトーシスパスウェイへの新しい視点－特にin situで－を得るために、ロシュ・ダイアグノスティックスはフルオレセイン標識 PARPカスパーゼ切断産物に対する抗体を提供します。この抗体は、非アポトーシス細胞にはアクセスせず、PARP-1のカスパーゼ切断部位に指向し、カ スパーゼにより作成されたエピトープを特異的に認識するために、アポトーシスの初期マーカーとして使用できます。

この使用が簡単な、カスパーゼシグナルに関する製品は、以下の利点を提供します：

• フローサイトメトリーおよびフルオレセイン標識物を使用しての蛍光顕微鏡による、迅速で簡単な検出
• 組織切片に対する免疫組織化学のための高感度テクニック
• TUNELとの組み合せなど、二重染色アプリケーション
• 初期から後期のステージまでのカスパーゼ活性化のステージにおけるアポトーシスパスウェイ分析（in situ）
• TUNELデータを補完する組織切片での初期アポトーシスの検出法

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
フルオレセイン標識PARP カスパーゼ切断産物抗体	3371131	50テスト	近日発売
	3371123	250テスト	近日発売
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BIOCHEMICA 2003 NUMBER 1（No. 90）