画期的なタンパク質発現システムであるRTS（Rapid Translation System）は，進化を続けます。 迅速なプロテインエンジニアリング：RTS100 システムによるトランケーションミュータントの発現

RTS（Rapid Translation System）コーナー

はじめに

ポストゲノム時代が始まった今、迅速なタンパク質発現は分子生物学分野における主要な仕事の一つです。大量のシークェンスデータから、コードされた遺伝 子に機能を割り振るために、ミュータジェネシス法が最も重要です。直鎖発現フラグメントを作成するためのPCR技術と、迅速なin vitro タンパク質発現法を組合わせることで、プロテインエンジニアリングのための新しいツールが創造されました。
RTS E. coli リニアテンプレート作成セットを使用して、2回のPCRでin vitro タンパク質発現用のDNAフラグメントが作成されました。興味のある遺伝子配列に全ての調節エレメントの付加とT7 RNAポリメラーゼをベースとするRTS100 E. coli HYシステムでのin vitro 発現後、多くのタンパク質と、そのミュータントが迅速に評価できました。

実験データ

48.8 kDaのヒトプロテインキナーゼの推定ドメインの機能は、その薬理学的関連性により興味が持たれます。シークェンスは、機能的に重要なタンパク質ドメイン を含む、いくつかのセグメントに配分されます（図1）。プライマーは7種のデレーションミュータントを作成するようにデザインされ、その遺伝子はPCRで 増幅されました。RTS E. coli リニアテンプレート作成セットのオーバーラップ伸長技術を使用して、in vitro 発現に必要なエレメントとC-末端にヒスチジンタグをコードするシークェンスが導入されました。

図1．ヒトプロテインキナーゼの機能研究用の様々な大きさのミュータントの概要。

直鎖フラグメントはRTS 100 HY反応で平行して4時間発現され、その後、ウェスタンブロットで検出されました。高発現量のスクリーニングは、野生型のプロテインキナーゼの、5種類の ミュータントが良い結果であったことを明らかにしました。PCRフラグメントから直接タンパク質を発現するための新しいツールは、プロテインエンジニアリ ングを大きく躍進させました。

図2．RTS E. coli リニアテンプレート作成セットで作成され、RTS 100 E. coli HY反応で発現された様々なデレーションミュータントのウェスタンブロット分析。
RTS 100反応溶液は、ヒスチジンタグ分子量マーカーと共に、SDS-PAGEで分離され、ブロットされた。検出はPOD標識抗His抗体で行われた。GFPが陽性コントロールとして用いられた。

2個の低収量のミュータントはウェブでのバイオインフォマティックスツールであるProteoExpertで分析されました。ProteoExpert は、大きく収量を増加させる可能性を持つ、サイレントN-末端ミューテーションを作成するためのアルゴリズムを提供します（www.proteoexpert.com）。その後、タンパク質の可溶性と活性に対する研究が続けられます。

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BIOCHEMICA 2002 NUMBER 3（No. 88）