TUNEL：In Situ アポトーシス細胞の同定法の 改良と評価

Tips & Facts

TUNELキット好評につき、1997年第2号の記事を改校、再掲載したものです。

はじめに

TUNEL法は、培養細胞調製品のアポトーシス細胞フラクションを迅速に同定、定量する際に、まず選択される方法として知られています。この方法が形態学的検出より好まれる理由としては、以下の2点が主なものです。

1. 過程が速い：クロマチンの凝集と細胞の断片化に2-5分、アポトーシス体の大食に3時間。
2. アポトーシス細胞の“形態”は広範囲にわたり、いくつかのニュアンスがある：アポトーシスの核は切断することなく凝集する。アポトーシスの初期では、核は、DNAが断片化を開始する間に伸長される。それ以上に核の形態は試料の固定法に強く依存する。

DNA断片への酵素の近接性は、DNAを取り囲んでいる核タンパク質により減少し、アルデヒド、パラホルムアルデヒド、フルムアルデヒドによる固定化やエタノールによるポスト固定化により損なわれます。
TUNELの感度と特異性を改良するために、各種の固定法と前処理法を検討し、至適なTUNELプロトコールを考案しました。

材料と方法

固定化

－6種類の固定液（パラフォルムアルデヒド、フォルマリン、B5、メタノール、BOUIN、アセトン）を検討。

前処理法

－界面活性剤（0.1% Triton X-100、氷上2分間）、プロテアーゼ（プロティナーゼK）、マイクロウェーブ照射とその後の急冷を検討。

TUNEL法

－3種類の変法（このラボ独自のプロトコール、ロシュ・ダイアグノスティックスのIn Situ Cell Death Detection Kit, POD、他社のIn Situ cell detection kit）。

結果と考察

TUNELプロトコール：3種類のTUNELプロトコールにおいて、感度と特異性については顕著な差は見られませんでした。しかし、ロ シュ・ダイアグノスティックスのキットで最も高いパーセントのTUNEL陽性アポトーシス細胞が得られ、最高のシグナル／バックグランド比が得られまし た。また操作も一番簡単でした。

固定：固定の方法に関わらず形態学的な同定は可能です。しかし、クロマチンの外観には大きな差異があり、Bouin液固定では最適、メタノール固定では不良でした（図1参照）。

図1．TUNELにおける固定液の効果。
CEM-C7細胞を以下の固定液で処理した。

A）4% パラフォルムアルデヒド；
B）4% フォルムアルデヒド；
C）B5；
D）メタノール；
E）Bouin液； F）アセトン。
電子線照射を使用し、TUNELはロシュ・ダイアグノスティックスのキットで行った。倍率：x 132. バーの長さは5μm。典型的なアポトーシスの形態を表す細胞は矢印で示している。

結果と考察

前処理：前処理無しでは、5種類の固定液ではアポトーシスの形態を持つ細胞の20%以下しかラベルされず、アセトン固定でも55%でした。

感度：もっとも感度を上げたのはマイクロウェーブ照射（370 W、5分）で、2-30倍向上し、すべての固定液で90%以上のアポトーシス細胞がラベルされました。界面活性剤は効果があまりありませんでした。プロ ティナーゼK処理は、感度を改善しましたがマイクロウェーブ照射の1/2でした。

図2. TUNELにおける前処理の効果。
細胞はBouin液で固定され、ロシュ・ダイアグノスティックスのキットでTUNELを行った。倍率：x 132. バーの長さは5μm。

（A）TUNELの感度は固定法に関わらず、前処理無しでは不十分であった。アポトーシスの形態を持つほとんどのCEM-C7細胞が標識されていない事に注意（矢印）。
（B）界面活性剤（Triton）はわずかに感度を改善したが、まだ多くのアポトーシス細胞が未標識のままである（矢印）。
（c）形態を指標とし、マイクロウェーブでの前処理がベストな条件であった。

特異性：

メタノールとアセトン固定の試料以外は、前処理により特異性が失われる事はありませんでした。プロティナーゼ K処理はメタノール、アセトン固定で、正常細胞核のラベルを劇的に増加させました。しかし、マイクロウェーブ照射が一番効果的でした。

結論

アポトーシスの比較可能な定量化は、サンプルの固定と前処理の標準化を前提とします。標識は、一般的なバックグランドと比較して強く、生細胞やネクローシス細胞の特徴を欠いた細胞に局在する時のみ、特異的であると受容すべきです。

詳細は、BIOCHEMICA 97 No.2（www.roche-applied-science.com）で！

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
In Situ Cell Death Detection Kit, POD	1684817	1 Kit （50テスト）	←製品番号をクリック
TUNEL Label	1767291	3 x 50μl （30テスト）	←製品番号をクリック
Proteinase K	1413783	5ml	←製品番号をクリック
	1373196	25ml	←製品番号をクリック
	1373200	1.25ml	←製品番号をクリック
Triton X-100	1332481	5 x 10ml	←製品番号をクリック
	789704	100ml	←製品番号をクリック

BIOCHEMICA 2002 NUMBER 2（No. 87）