＜結核菌（M.tuberculosis）のRFLP解析の標準化と省力化-検査室におけるDIGシステム＞

DIG コーナー

はじめに

結核菌の疫学マーカーとして以前は，薬剤感受性パターンやファージ型別が用いられていましたが，より特異性の高いIS6110をプローブとしたRFLP の有用性が90年代に数多く報告され，日本においても結核研究所にて広く研究され，現在では最も有効な方法として利用されています．当所においても、安全 実験室の整備を機会に、三重県内で発生した集団感染の疑いのある事例についてRFLPを実施することとなりました。しかし、本法の手技は決して簡便とは言 えず、他の業務に支障が出ないよう極力省力化するため、DIGシステムを採用して試薬調製の手間を省いています。

材料と方法

1）DIG標識DNAプローブの作成

PCR DIGプローブ合成キットの取扱説明書に従い、以下の操作手順で標識プローブを作成した。テンプレートDNAの調製には、市販DNA抽出キットを用いた。

反応溶液の調製：

試薬	容量
滅菌再蒸留水	30.25μl
10x PCRバッファー（バイアル3）	5μl
PCR DIGラベリングミックス（バイアル2）	5μl
プライマーISN-1, ISN-2（50μM）	各2μl
Expand HF酵素ミックス（バイアル1）	0.75μl
テンプレートDNA	5μl
トータル	50μl

サーマルサイクラーの温度プロファイル：

	温度	時間	サイクル数
最初の変性	95℃	2分
変性 アニーリング 伸長	94℃ 60℃ 72℃	10秒 30秒 2分	40ｘ
最終の伸長	72℃	7分

作成したプローブはスピンカラムで精製し、10μLづつマイクロチューブに分注して、-20℃で保存した。

2）ブロットの作成

1. 市販DNA抽出キットを用いて結核菌から抽出したDNAをPvu IIで切断後，DIG標識DNAサイズマーカーIIIと共に0.8%アガロースで電気泳動分離
2. アルカリ変性溶液（0.5N NaOH，1.5M NaCl）でゲルを室温、15分×2回処理
3. 蒸留水で洗浄
4. 中和溶液（0.5M Tris-HCl，3M NaCl pH7.5）でゲルを室温、15分×2回処理
5. 3時間～O/Nのキャピラリー・トランスファー（20×SSC，GIBCO BRL）でニトロセルロースメンブレンへ転写
6. UV固定（120mJ）
7. 蒸留水で洗浄

3）ハイブリダイゼーション

1. DIG Easy Hyb（30mL/100cm２）を使用してDNAオーブン内で42℃、30分のプレハイブリダイゼーション
2. ハイブリダイゼーション溶液（DIG Easy Hyb 30mL＋変性したプローブ 10μL）を使用してDNAオーブンで42℃、O/Nのハイブリダイゼーション
   ［再利用する場合は，ハイブリダイゼーション溶液を回収し、日付とプローブ名を明記し－20℃保存した。］
3. 2×洗浄液（2×SSC，0.1%SDS）で振盪しながら室温で洗浄（5分×2回）
4. 0.1×洗浄液（0.1×SSC，0.1%SDS）で振盪しながら42℃で洗浄（5分×2回）

4）DIG化学発光検出

1. 検出系で必要となる各種バッファーの調製にはDIG洗浄＆ブロックバッファーセットを利用した。～の各ステップは、室温で振とうしながら行った。
2. 1×洗浄バッファーで1分リンス
3. 1×ブロッキング溶液（30mL）で30分インキュベート
4. 希釈抗体溶液（1×ブロッキング溶液30mL＋AP標識抗DIG抗体1.5μL）中で30分インキュベート
5. 1×洗浄バッファー（100mL）で15分、2回洗浄
6. 1×検出バッファー（30mL）中で2分平衡化
7. CPD-Star, ready-to-use（0.5mL/100cm２）をメンブレンへアプライ
8. メンブレンの入ったハイブリダイゼーションバックをシール

図1.M.tuberculosis のRFLP解析

結果と考察

図1に示したように、Lane 1～Lane 4の検体が同一のパターンを示し、保健所の調査を裏付ける結果となりました。結核菌の疫学マーカーとしてIS6110をプローブとしたRFLPの有効性に ついては、多くの報告により実証されていますが、その手技は煩雑です。当所のように行政に属する研究機関では、転勤による人の入れ替わりが常に考えられ、 一定以上のクオリティを得ることと、突然の依頼に対して、他の業務への影響を最小限とするために、コストは高くなるものの、市販キット等の導入が有効で あったと思われます。

参考文献

1. Van Embden J.D.A.，Cave M.D.，Crawford J.T. et al.（1993）Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J.Clin.Microbiol.，31，406-409
2. 高橋光良（1998）RFLP分析を用いた結核菌の分子疫学，日本細菌学雑誌，53，662-668
3. DIGシステムを用いてハイブリダイゼーションを行うためのユーザーガイド 第2版，Roche Diagnostics GmbH
4. Tabet S.R, Goldbaum G.M, Hooton T.M et al（1993）Restriction fragment polymorphism analysis detecting a community based tuberculosis out break among persons infected with human immunodeficiency virus, J. Infect. Dis., 169, 189-192
5. Takahashi M., Kazumi Y., Fukuzawa Y. et al（1993）Restriction fragment length polymorphism analysis of epidemiologically related Mycobacterium tuberculosis isolates, Microbio. Immunol., 37, 289-294

（今回、三重県科学技術振興センター 保健環境研究部 微生物研究グループの岩出 義人先生のご厚意によりご提供頂きました。）

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
	1636090	1キット（25回標識分）	←製品番号をクリック
DIG標識DNA MWM	1218603	5μg（500μl）	←製品番号をクリック
DIG Easy Hyb	1603558	500ml	←製品番号をクリック
DIG Wach & Block Buffer Set	1585762	1セット（30ブロット分）	←製品番号をクリック<
Anti-DIG-AP,Fab fragment	1093274	150U（200μl）	←製品番号をクリック
CDP-Star,ready-to-use	2041677	2x50ml	←製品番号をクリック
Lumi-Imager F1 Work Station	2012847	1台	ご照会

BIOCHEMICA 2002 NUMBER 2（No. 87）