Geno Pure プラスミドキット －RTSでのin vitro タンパク質発現のための プラスミドDNA精製キット

Tips & Facts

はじめに

ラピッドトランスレーションシステム（RTS）は、T7ポリメラーゼとE. coli ライセートに基づく、高収量なin vitro タンパク質発現システムです。中、小スケールフォーマットでの発現は前核細胞タンパク質発現に至適化されたプラスミドDNAを用いて達成されます。RTS タンパク質発現反応において高純度のプラスミドが要求されるため、通常、プラスミドは陰イオン交換クロマトグラフィーにより調製されます。新しいGeno Pure DNAミディおよびマキシキットで分離されたDNAがRTSでの発現に試験されました。

図1．様々なpIVEX2.3-GFP反応物からのRTS 100 HY反応で発現されたGFP蛍光活性の定量。

材料と方法

グリーンフルオレッセントタンパク質（GFP）遺伝子をコードするプラスミドpIVEX2.3-GFPが、E. coli XL1ブルーから使用説明書通りに単離された。セルフリー発現実験は、RTS 500 HYとRTS 100 HYキットの説明書に従い行った。7.5μgのプラスミドをRTS 500 HY、0.5μgをRTS 100 HYでの、テンプレートとして使用した。

結果と討論

GFPとC-末端のHis₆タグをコードするpIVEX構築物からのプラスミドDNA（pIVEX2.3-GFP）を、Geno Pureプラスミドミディとマキシキットで調製した。この2種類のキットを用いての調製品は、高い純度と高収量のDNAという結果をもたらした。様々な DNAサンプルの中スケール（RTS 500 HY）および小スケール（RTS 100 HY）への適合性は、以下のように分析された。RTS 100 HYシステムでのGFPのin vitro 合成後、蛍光強度が測定された（図1）。同様の結果がRTS 500反応でも得られた。DNAサンプルから作成された合成GFPの品質はウェスタンブロットで分析された（図2）。図が示すように、Geno Pureプラスミドキットで調製されたDNAは、RTS 100からRTS 500へのスケールアップ反応に適していた。それゆえ、RTS 500 HYからRTS 9000 HYへの、そのままのスケールアップが期待される。新しいGeno Pureプラスミドマキシおよびミディキットは、このアプリケーションの厳しい要求に合致し、ラピッドトランスレーションシステムでのテンプレートとして 使用される、プラスミドDNAの分離に強く推奨される。

図2．RTS 500 HY反応で発現後のGFPのウェスタンブロット分析。
等容量の希釈反応液をSDS-PAGEで分離し、ブロットした。検出は、POD標識抗His₆抗体で行った。

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BIOCHEMICA 2002 NUMBER 2（No. 87）