画期的なタンパク質発現システムであるRTS（Rapid Translation System）は、進化を続けます。 RTSに第2世代登場!! －ミリグラムスケールのタンパク質発現を達成したRTS 500 E. coli HY キット

RTS 500（Rapid Translation System）コーナー

現在までセルフリータンパク質発現は、その収量の少なさのため、分析ツールとしてのみ使用されてきました。ラピッドトランスレーション システム RTS 500 HYを使用することで、ミリグラムオーダーのタンパク質が24時間以内に発現できます。X-線やNMR分析に、経済的に高い特異性でタンパク質の標識が可 能です。

はじめに

ヒトゲノムプロジェクトの完成後、多くの構造ゲノミクスの手始めは、タンパク質レベルでの性質の、作用における基本的理解を促進することでした。この目 的のために、簡便に高い収量が得られ、自動化も可能な迅速タンパク質発現システムが要求されます。セルフリータンパク質発現は、細胞を取り扱う（トランス フォーメーション、発酵、溶解など）必要が無いため、上記の要求に合う高い潜在能力を持っています。実際、この手法は溶液の取り扱いのみですので、自動化 プロセスに適用可能です。
低収量はセルフリータンパク質発現における制限で、この方法を分析用ツールに限っています。2000年における、RTS 500 E. coli環状テンプレートキットの開発は、セルフリータンパク質発現の調製スケールへの第一歩における注目すべきものでした。新たに開発されたRTS 500 E. coliHY キットは、今や1日以内に5 mg/mlの発現を可能にします。このキットは連続交換セルフリー（CECF）テクノロジーを使用し、RTS 500 E. coli環状テンプレートキットの反応条件を改良しています（表1）。小スケールのタンパク質発現用のRTS 100 E. coliHY キットの導入と共に、このキットは遺伝子からタンパク質への実験のスピードアップを可能にします。アミノ酸は、反応およびエネルギーミックスとは別包装ですので、標識アミノ酸の取込みが可能なデザインとなっています。

表1：RTS 100およびRTS 500の特徴

	RTS 100 E. coliHY キット	RTS 500 E. coliHY キット	RTS 500E. coli環状 テンプレートキット
CECFテクノロジー	×	○	○
HYバイオケミストリー	○	○	×
標準反応液量	50μl	1 ml	1 ml
RTSインスツルメント	必要無し	必要	必要
標準反応時間	2-4時間	24時間	24時間
タンパク質の収量	400μg/mlまで	5 mg/mlまで	500μg/mlまで

材料と方法

ラピッドトランスレーション システム RTS 100 E. coliHY、RTS 500 E. coli環状テンプレートキット、RTS 500 E. coliHY キットを説明書通り使用した。グリーンフルオレッセントタンパク質（GFP）発現の場合、反応槽は酸化的成熟を促すため、半分まで満たされた。一般的に、 合成タンパク質は、単離されたタンパク質をリファレンスとして、SDS-PAGEでのクマシーブルー染色、必要に応じ活性化試験（GFPの蛍光）で定量化 された。セレノ-メチオニンによる標識では、標準プロトコールを0.5 mM（終濃度）のセレノ-メチオニンで置き換えた。

図1. RTS 500での連続交換セルフリー（CECF）遺伝子発現。 RTS 500容器は、反応槽、半透膜、フィーディング槽より構成される。トランスクリプションとトランスレーションは反応槽で同時に進行する。

結果

新しいRTS 500 E. coliHY キットはCECFテクノロジーに基づいています。RTS 500 E. coli環状テンプレートキットと同様、このテクノロジーの要である容器は、1 mlの反応槽と10 mlのフィーディング槽が10 kDの膜で分離されています。セットアップにより、トランスクリプション／トランスレーション反応に必須の成分が連続的に補充されます（図1）。タンパク 質発現は24時間まで進行し、CECFテクノロジーを使用しいない他の方法と比較し、高い収量が得られます。
生化学成分の変更により、RTS 500 E. coli環状テンプレートキットの10倍以上の収量を達成した高収量バージョンです（図2）。

図2. RTS 500 E. coliHY キットとRTS 500 E. coli環状テンプレートキットの比較。 様々なサイズと性質のタンパク質をHYキット（a）と環状テンプレートキットで発現させた。

RTS 100 E. coliHY キットにおいても同様の反応条件を使用しているため、この二つのキットは一緒に使用できます。RTS 100 E. coliHY キットによる経済的な条件のスクリーニング（一つの遺伝子の様々な配列の変動体など）の後、同一条件でRTS 500 E. coliHY キットにより、更なる分析に十分な量のタンパク質を得ることが可能です。

タンパク質の収量は構造解析に十分なため、セレノ-メチオニンの取込みがテストされました。メチオニンの代わりに、同じ濃度のセレノ-メチオニンを使用 することで、すべてのメチオニンを置き換えることができました。これはマススペクトロスコピーで確認されました（図3）。メチオニンはキット内のすべての 試薬とは別包装ですので、容易に置き換えが可能です。

図3. セレノ-メチオニン標識GFPのマススペクトロスコピー分析。 232 Daの質量でのシフトは、期待通りの5個のセレノ-メチオニン（5 x 46.9 = 234.5）の取込みを示している。

同様に、NMRスペクトロスコピーに使用するために、標識アミノ酸とアミノ酸の交換がテストされました（下の記事をご覧ください）。この目的のために、RTAアミノ酸サンプラーと標識アミノ酸を使用して、望みのすべてのアミノ酸を置き換えることが可能です。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
RTS 500 E.coliHYキット	3246817	1キット (2回反応)	←製品番号をクリック
	3246949	1キット (5回反応)	←製品番号をクリック

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
RTS 500 コントロールユニット	3064859	1台	←製品番号をクリック
RTS 100 E.coliHYキット	3186148	1キット (24回反応)	←製品番号をクリック
	3186156	1キット (96回反応)	←製品番号をクリック

詳細はインターネットで!!→
http://www.proteinexpression.com/

BIOCHEMICA 2001 NUMBER 4（No. 85）