NEW! MagNA Pure LC DNAアイソレーションキット III（バクテリア、カビ用）－様々なサンプル材料よりのバクテリアDNAの自動分離

ライトサイクラー & MagNA Pure LC コーナー

様々なサンプル材料よりのバクテリアDNAの効率的な分離が、PCRによるバクテリアの迅速で高感度な検出に重要とされます。特に自動 化は、微生物研究室には大きな助けとなります。この目的より、MagNA Pure LCで使用される、DNAアイソレーションキット III（バクテリア、カビ用）を開発しました。キットは様々な難しいサンプル材料、肺胞洗浄液（BAL）、尿、喀痰、糞便、スワッブ、脊髄液（CFL）、 気管分泌物、血液、培養バクテリアで試験されました。

材料と方法

サンプルの調製

調製法は、大きくサンプル材料のタイプに依存する。BAL、喀痰、CSF、糞便などは密度や粘度が大きく変動する。

液化（オプション）

粘度の大変高いサンプル（BAL、喀痰）は同容量の0.3％ DTT溶液を加え、37℃でピペッティングが可能になるまでインキュベートした（約30分）。

バクテリアおよびカビのスパイク

既知数のStaphylococcus aureus 、E. coli 、Helicobacter pylori をサンプルにスパイクした。他のバクテリアの細胞数は、培養懸濁液から直接分析した。カビに関しては、Aspergillus fumigatus とCandida albicans をスパイクに使用した。

遠心（オプション）

大容量で、少数および未知数のバクテリアをスパイクされた液状サンプルは、遠心によりバクテリアをペレットとして沈殿させた。ほとんどの上澄は捨て、ペレットとわずかな上澄（50-100μl）を使用した。

バクテリア溶解バッファー／プロティナーゼ Kの添加<

130μlのバクテリア溶解バッファーと20μlのプロティナーゼ Kをサンプルに加えた。混合後、65℃で10分間インキュベートした。粘度の高い、あるいは細胞の多いサンプルでは20－30分に延長した。

ボイリングによる失活

病原菌を失活化させるため、すべてのサンプルは95℃で10分間、煮沸された。煮沸後、放置冷却した。

特殊なサンプル材料

糞便：5-6容量のPBSに懸濁後、バクテリア溶解バッファーとプロティナーゼ Kを加えた。インキュベーション/ボイリングは上述通り。

スワッブ：バクテリア溶解バッファーとプロティナーゼ K中に入れ、65℃で10分間インキュベートした。水分を絞り出し、上述通りボイルした。

培養血：100μlの血液培養培地を上記の方法で調製したが、炭素粒子のキャリーオーバーが観察される場合がある。この場合は上澄を短く遠心した方が、より良い結果が得られた。

MagNA Pure LCによるDNAの分離

次に、ライセートをMagNA Pure LCのサンプルカートリッジに移し、キットの試薬と共にロードすることで、自動的にDNAが分離、精製された。精製DNAは溶出され、冷却保存カートリッジに移された。

ライトサイクラーによる分析

PCRはライトサイクラー上で、種特異的プライマーとハイブリダイゼーションプローブで行われた。PCR結果は、加えたDNAの量と質を表す交点（CP）を重視し、分析した。

結果と討論

BALサンプル（代表例）

このタイプのサンプル材料は、粘度と細胞含量に大きな変動を示す。しかし、最も粘度の高いサンプルも、上述の前処理を行うことで調製できた。6種類の粘度の異なるBALに、この種のサンプルに見つかる典型的なS. aureus 、を10⁵コ ロニーフォーミングユニット（CFU）/mlで、スパイクした。DNA分離後、すべてのサンプルでPCRが可能であった（図1）。最も高い粘度や細胞を持 つBALは、より高い交点を表し、これは至適で無い回収を意味している。このような場合、加えるサンプル量を減らすか、プロティナーゼ K処理を延長すべきである。逆に、微生物学試験でS. aureus が陽性であったBALでは、大変低いCPを見せている。これはこの特殊サンプル中のS. aureus のトータル数が、スパイク量よりもはるかに大きいことを示している。

図1. S. aureus （約105 CFU/ml）をスパイクした6種類のBALサンプルからの、DNAのLC-PCR。

結論

MagNA Pure LC DNAアイソレーションキット III（バクテリア、カビ用）は、幅広い研究サンプル材料で使用することができます。操作法は大きく自動化され、32サンプルが同時に調製されます。自動 化の部分はサンプル数に応じて60-90分となっています。調製時間の長さは、サンプルのタイプに大きく依存しています。ボイリング操作がサンプル中の病 原菌を失活するために推奨されます。

ほとんどすべてのサンプル材料が調製できることが示されました。分離されたDNAは高品質で、PCRの阻害は見られませんでした。LCで得られた感度は、他の分離法で達成されたものと同様でした。

20種以上のバクテリアが評価され、容易に検出されました（Mycobacterium やNocardia はアルカリ溶解などの特殊な溶解操作法が必要とされるため、今回テストしませんでした）。今回分析していない、他のグラム陽性並びに陰性細菌や、カビなども効率的に溶解でき、分離されたDNAは高感度にリアルタイムPCRで検出できるでしょう。

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BIOCHEMICA 2001 NUMBER 4（No. 85）