RTSにハイスループットタイプ－RTS100新登場!!
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はじめに
ここ数年、細胞をベースとするタンパク質発現の不便さを避けるため、特に多数の遺伝子をスクリーニングしたりタンパク質発現を至適化する際に、in vitro トランスレーション/トランスクリプションがタンパク質の合成に使用されてきました。
これらのアプリケーションにはハイスループットが重要ですが、RTS100は数時間で多くのタンパク質を同時に発現できます。PCR産物がテンプレートとして使用できますので、RTS100 E.coli HYキットは時間のかかるクローニングステップを必要としません。反応はわずか4時間と、大きくタンパク質発現にかかる時間を減少させています。 RTS100の開かれたフォーマットにより、研究者はタンパク質発現を至適化するために、界面活性剤やシャペロンを加え、可溶性や活性の増加や正しい フォールディングをさせたりするために、成分を変更することができます。
材料と方法
in vitro タンパク質合成反応のセットアップ
ラピッドトランスレーションシステム RTS100 E.coli HYキットは能書通り使用した。50μlの反応において、12μlのE.coli ライセート、10μlの反応ミックス、12μlのアミノ酸、1μlのメチオニン、5μlの再懸濁バッファー、1μlのテンプレートDNAを、DNaseお よびRNaseフリー蒸留水で50μlに調整した。反応はシェーカー中30℃で4時間行われた。グリーンフルオレッセントタンパク質（GFP）の合成量 は、タンパク質としての機能の測定と、SDS電気泳動とクマシーブルー染色により決定された。
RI標識
25μlの反応液に、2μlの15 mCi/ml L-[35S]メチオニン（SJ235 アマシャム）（終濃度1.25μM）、またはメチオニンの終濃度50 μMが得られるように、2μlの15 mCi/ml L-[35S]メチオニンと未標識のメチオニンを加えた。30℃で10-60分後、反応液から2μlのサンプルを取り出し、10%のSDS-PAGEで分離した。乾燥させたゲルをコダックのX-OMAT ARフィルム上にアプライし、オートラジオグラフィーを行った（3時間露光）。
スタンダードPCR
50μlのPCR反応のために、37.2μlのH2O、5μlの10 x PCRバッファー（MgSO4含 有-終濃度2 mM）、1.25μlのdNTPミックス（各10 mM）、2.5μlのセンスプライマー（10 pmol/μl）、2.5μlのアンチセンスプライマー（10 pmol/μl）、0.5μlのPwo DNAポリメラーゼ（5 U/μl）、1μlのテンプレートDNA（1 ng/μl）を使用し、以下のPCRプロトコールを行った：4分/94℃；1分/94℃；1分/65℃；1分/72℃；トータル20サイクル。
pIVEX2.3ベクターにクローニングされた表示の遺伝子は、センスプライマー（５'－ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＣＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＴＣ－３'）とアンチセンスプライマー（５'－ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＣＣＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＣＧ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＧＣ ＣＣＣ ＡＡＧ Ｇ－３'）と共に使用された。PCR産物の濃度は、1%のアガロースゲルで推計され、in vitro タンパク質合成に直接使用された。
2ステップPCR
興味ある遺伝子に調節エレメントを附加するために、2種類のプライマー対での2ステップPCRプロトコールがデザインされた（図1）。
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図1：2ステップPCR反応の原理 |
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より内側のプライマーAとBでの、最初の20サイクルのPCRは上記のプロトコールに従い行われた。通常、興味ある遺伝子へのプライマーの15塩基重複 部位で、プライミングに十分である。この反応からの2μlをテンプレートとして、30サイクルのプライマーCとDでのセカンドPCRに加えた。1μgの作 成された構築物をin vitro 合成反応に加えた。
→内側のプライマー（下線で示した配列は、内側と外側のプライマーの重複部位である）：
A：リボゾーム結合部位（RBS）と遺伝子の開始部位（X1-X15）を含んでいる
(5'-AGAAGGAGATATACC-X1-X15-3')
B：テンプレート遺伝子の終末（Y1-Y15）とストップコドン、翻訳されないスペーサーを含んでいる
(5'-AGGATTAGTTTATTA-Y1-15-3')
→外側のプライマー：
C：T7プロモーター、遺伝子10、RBSを含んでいる
(5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAGAAGGAGATATACCC-3')
D：Ｔ5トランスクリプションターミネーターと翻訳されないスペーサーを含む
(5'-AAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTGGGAGTAGAATGTTAAGGATTAGTTTATTA-3')
結果と考察
直鎖（PCRにより作成）やプラスミドテンプレートに対して、高い生産性を持つE.coli ライセートを開発するために、低ヌクレアーゼのE.coli 株からライセートを調製しました。その上に、ヌクレアーゼインヒビター（パテント申請中）が加えられました。この新しいラピッドトランスレーションシステム RTS100 HYキットの高いタンパク質合成能が、他のサプライアーのE.coli ライセートシステムとの比較で実証されました（図2）。
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図2. 新しいラピッドトランスレーションシステム RTS100 HYキットと他のサプライアーのE.coli ライセートシステムとの比較。 |
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1ステップPCRで作成されたGFPテンプレートと、GFP遺伝子を含む発現プラスミドが、in vitro タンパク質合成反応で使用されました。直鎖では400μg/mlまで、プラスミドテンプレートでは600μg/mlまでのタンパク質が、ラピッドトランス レーションシステム RTS100 HYキットを使用して、4時間の反応で得られました。他のサプライヤーのキットでは、非常に弱いGFPの蛍光が検出されただけでした。
タンパク質合成結果のチェック
各タンパク質発現の成功は以下の方法で評価されました。
→タンパク質の機能アッセイ
→タンパク質やペプチドタグに対する抗体を使用してのウェスタンブロッティング
→SDSゲルとクマシーブルー染色（強い発現）、あるいは
→メチオニンによるRI標識
以下の実験は、L-[35S]メチオニンの10分間の標識反応で、標識メチオニンのみを使用してのGFPタンパク質の合成が、十分 に検出できることを示唆しています（図3、レーン1）。β-ガラクトシダーゼなどの巨大タンパク質や、より多くのメチオニン残基を持つタンパク質は、途中 で停止するのを防ぐために、50μMの未標識メチオニンの添加が必要とされます（図3、レーン2、3、4）。
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図3. L-[35S]メチオニンによるRI標識。
ゲルA：未標識メチオニン無し。ゲルB：+50μMの未標識メチオニン。 |
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1日で遺伝子からタンパク質を
RTS100 E.coli HYキットが、2ステップPCRで作成されたDNAテンプレートからの直接タンパク質合成に用いられました。この実験例で、調節エレメントであるT7プロ モーター、RBS、T7ターミネーターが、図1に示された2ステップPCRで融合されました。相当するアンチセンスプライマーを用いることで、His6タグがタンパク質のC末端に融合され、ウェスタンブロットでの検出が可能となりました（図4）。
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図4.ウェスタンブロット：
2ステップPCRで作成したテンプレートから発現。 |
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Order INFO
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製品名 |
製品番号 |
包装単位 |
希望価格 |
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RTS100 E.coli HYキット |
3186148 |
1キット
(24回反応) |
←製品番号をクリック |
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製品名 |
製品番号 |
包装単位 |
希望価格 |
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RTS500 コントロールユニット |
3064859 |
1台 |
←製品番号をクリック |
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RTS500 E.coli (環状テンプレート用) |
3018008 |
1キット
(5回反応) |
←製品番号をクリック |
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詳細はインターネットで!!→http://www.proteinexpression.com/ |
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BIOCHEMICA 2001 NUMBER 3（No. 84） |
〒105-0014 東京都港区芝2-6-1