オンコロジー研究に－LightCycler CK20 定量キット

ライトサイクラー/MagNA Pure LC コーナー

－ヒトサイトケラチン20をエンコードするmRNAの最も感度の良い定量法－

新発売のライトサイクラー-CK20定量キットは，オンコロジー研究分野のパラメーター特異的試薬を拡張しました。このキットは10⁶個の末梢血細胞から，わずか1個のCK20陽性細胞の定量的検出を可能とします。

背景

転移期が無いにもかかわらず起こる多くの腫瘍の再発は，従来の方法では正確に検出できない，微少転移によると信じられています。その増大した感度のため，PCRを ベースにした方法は，微少転移の検出を可能とするツールとしての研究がなされています。この目的のために多くのマーカーが，制限された発現パターンを持つ 第一の候補者としての，その適合性を評価されてきました。異質の環境でのそれら遺伝子の発現は，腫瘍細胞の浸出の潜在的な指標と考えられます。ヒトサイト ケラチン20（CK20）は，細胞内骨格に関与している，中間フィラメントファミリーの上皮サブグループに属しています。すべての他のサイトケラチンと同様に，その発現は組織のタイプにより変動しています。その制限された発現により，CK20は第一に結腸直腸ガンや尿路上皮ガンにおいて，微少転移のマーカーの第一候補として研究されてきました。CK20の検出は，再発リスクの増大や腫瘍のステージに相関しています。

製品の記述

ライトサイクラー-CK20定量キットは，ライトサイクラー機器を使用してのキャピラリーガラス内でのPCR用に，特別に調整されています。サイトケラチン20(CK20) RNAの検出は，2ステップの操作法で行われます。最初のステップで，AMVリバーストランスクリプターゼとランダムヘキサマーのプライマーにより，RNAからcDNAが逆転写されます。第2のステップで，特異的なプライマーを使用してのPCRで，cDNAからCK-20エンコードmRNAの124 bpフラグメントが増幅されます。アンプリコンは，特異的なハイブリダイゼーションプローブ対により，蛍光検出されます。同じDNA調製品を別のPCR反応で使用して，ポルフォビリノーゲン デアミナーゼ（PBGD）をエンコードしたmRNAがリファレンスの遺伝子として生成されます。反応産物はRNAの完全度のコントロール，および相対的定量のリファレンスとして役立ちます。CK20 mRNA量を測定するために，ライトサイクラーの新しい相対的定量ソフトウェアが応用されます。キット性能の詳細は，下記の“ライトサイクラーでのサイトケラチン20の相対的定量”の記事をご覧ください。

表1：ライトサイクラー-CK20定量キット

アッセイの特徴

分析感度 →10コピー以下のCK20核酸配列を検出 （リファレンスとしてCK20プラスミドDNAを使用しての典型的なシステムで）

測定範囲 →アッセイの直線的測定範囲は，102-106 CK20コピー数（CK20プラスミドDNAを使用しての典型的なシステムで）

特色と利点

定量的結果 →リファレンス遺伝子と相対する，ヒトCK 20 mRNAレベルの定量的測定。キャリブレーターRNAの量で標準化されます。 利点：他のパラメーターへのCK20 mRNAレベルの較正

簡便な取り扱い →レディー・ツー・ユースのミックス →試薬は機能試験済みで，簡単な使用が可能な，簡便なレディー・ツー・ユースの溶液で供給されます。 利点：熟練した知識を必要としません。

迅速な実行と手間の減少 →増幅と定量は，ライトサイクラーに機器で，組み合わされた操作法で行われます。 利点：時間の短縮/労働コストの削減。結果は2時間以内に得られます。

信頼性のある性能/標準化のキットコンセプト →プライマーとハイブリダイゼーションプローブは配列特異的です。 →最大の特異性と感度を実現するために，ファストスタート Taq DNAポリメラーゼが“ホットスタート”成分として使用されます。 →キットは，ポジティブコントロールテンプレートとして，キャリブレーターRNAを含みます。 利点：結果は明瞭で，ランや個別のサンプル間で比較できます。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
LightCycler CK20 定量キット	3118835	96回反応	ご照会
ライトサイクラー 相対定量ソフトウェア	3158527	1パック	ご照会

ライトサイクラーでのサイトケラチン20の相対的定量

－研究サンプルでの微少転移の検出へ洞察をもたらす革新－

はじめに

従来の方法では検出不可能な残余の腫瘍細胞は，表面的な腫瘍切除後のガン再発の原因であるとされています。組織および腫瘍特異的遺伝子のRT-PCR増幅による，血液や骨髄，リンパ節などの腫瘍外サンプル中の，“微少転移”あるいは“最少残余疾患”と呼ばれるものの検出の可能性は，最近における研究の増加を駆り立てています。微少転移のマーカーの有望な第一候補は，サイトケラチン20（CK20）です。発現研究は，その発現が胃腸組織，胸部移行性およびMerkel細胞ガンに制限されることを見出しました。それゆえ，腫瘍外サンプル内のCK20の検出はこれらの，腫瘍からの転移を指標するでしょう。しかし，いくつかの研究はCK20のRT-PCR検出とステージ，程度，再発の間の関連を見つけましたが，他の研究は，差異の無さや非特異的検出を報告しました。

RT-PCRによる微少転移の検出の実行可能性を決定するためには，このような不一致の理由を説明することが必要です。PCR分析の定性的性質や，日にちの経った研究間の標準化が不足しているために，この説明は困難になっていました。ロシュ・ダイアグノスティックスではこの限界を克服する，CK20 RNAの検出のための，新しい定量的RT-PCRアッセイであるライトサイクラー-CK20定量キットを開発しました。

材料と方法

逆転写

cDNAは10μlのRNA，1μlのライトサイクラー-CK20 リバーストランスクリプターゼ，4μlの反応ミックス，2μlのdNTPs，1μlのランダムヘキサマーを含む20μlの反応液中で作成された。反応液は25℃で10分間，42℃で30分間，94℃で5分間インキュベートされた。

ライトサイクラー PCR

ライトサイクラーでのPCR増幅と検出は，DNAハイブリダイゼーションプローブフォーマットで行った。各反応液20μlは，2μlのcDNA，2μlのCK-20酵素マスターミックス，2μlの検出ミックス（プライマーとハイブリダイゼーションプローブを含む）あるいはCK-20リファレンス検出ミックス（プライマーとハイブリダイゼーションプローブを含む）を含む。各サンプル毎に2つの反応，1つはCK-20で1つはリファレンス遺伝子PBGDを，別のキャピラリーで行った。ライトサイクラー機器内で最初に94℃で1分インキュベートした後，94℃で0秒，60℃で10秒，72℃で5秒を50サイクル実行した。PCRのランは40で30秒のインキュベーションで終了した。蛍光は，各60℃のインキュベーションの最後にモニターされた。チャンネルF2/F1で検出された蛍光は，ライトサイクラーの分析ソフトウェアを使用して解析された。各反応の交点が，セカンドデリバティブ・マキシマムアルゴリズムと算術的ベースライン調節を用いて，測定された。

PCR定量

CK20を定量するために，キャリブレーターサンプルのCK20とPBGDの比に相対する，未知サンプル中のCK20とPBGDの比を，ライトサイクラー相対定量ソフトウェアを用いて測定した。キャリブレーターは各ランに含まれ，1,000,000の値にセットされた－それゆえ10,000の比であるサンプルは，キャリブレーターよりCK20が100倍少ない。相対的なCK20の比を測定することはPCR反応の効率を見て，未知とキャリブレーターサンプルのCK20とPBGDの交点を決定する機能を持つ。

結果と討論

以前の微少転移マーカーの検出アッセイは，ネステッドRT-PCRとそれに続くアガロースゲル上での可視化より成り，定量的に限界のある解析法でした。ロシュ・ダイアグノスティックスはライトサイクラー-CK20定量キットを開発し，微少転移の検出に顕著な優位性を提供しました。

ラージスケールの解析処理が可能

反応濃度の至適化と反応ミックスの提供により必要な操作手順が最小限になり，ライトサイクラーのクローズシステムであるキャピラリーと共に，クロスコンタミネーションの危険性を減らします。迅速なキャピラリー熱サイクリングを使用することで，45分のPCRを含みすべてのアッセイが2時間で完了しますので，多検体の解析処理が可能となります。

最も高い特異性

CK20とPBGDにおいて，PCR検出は4個の配列特異的オリゴヌクレオチドがアニーリングした時のみに行われます。これらのプライマーとハイブリダイゼーションプローブは，ゲノムDNA検出の可能性を除外するために，エクソン-イントロンの境界に渡るようにデザインされています。

交点でのPCR産物の定量

このアッセイの主要な特徴は，ライトサイクラーを使用してPCR量のモニタリングと定量が出来ることです。ハイブリダイゼーションフォーマットの使用により，すべてのPCR反応過程が蛍光検出によりモニターされ，定量の最も信頼できる時点と考えられている，検出可能な指数期の開始点（“交点”）での測定を可能にします。

検出限界の改善

“ホットスタート”PCR酵素（ファストスタートTaq DNAポリメラーゼ）の使用により，プライマー・ダイマーの形成が減少され，微少転移の検出に関連する低コピー数において重要な利点である，最大の感度が保証されます。感度試験は従来のアッセイの検出限界を改善していることを示しています。スパイク実験では，1 mlの血液や10⁵個のHL60前骨髄性白血病細胞のバックグランドにおいて，1個のHT29結腸直腸細胞からのCK20を検出することが出来ました。スパイクしないバックグランド細胞はネガティブでした（データ不掲載）。プラスミド希釈実験では，1コピーのCK20とPBGDが検出できました（図1）。

標準化された定量

アッセイの開発に加え，使用される定量モデルもまた重要な検討点でした。交点はサンプル量の指標を提供しますが，それらの標準化と比較化できる値の解釈に適したモデルは，いまだ確立されていません。効率により調整された相対的定量モデルが，新しいライトサイクラー 相対定量ソフトウェアに備えられました。これは定量に潜在的に影響する因子をコントロールする3種類の要素を含むため，再現性が最大となります。

最初の要素は，ハウスキーピング遺伝子PBGD量の計算への包括です。これはRNAのローディングと完全度のPCRコントロールを提供し，事前のRNA量の推定を必要としなくさせます。これはロードされたコピー数のスタンダード曲線とRNA量の吸光度による評価により大いに信頼されている絶対コピー数の定量法より，妥当性のある説明を与えます。第二の要素は，各RT-PCRランでのキャリブレーターとそのCK2とPBGDの比を各サンプルの計算に包括していることです。キャリブレーター比の包括は，PCRラン間の変動の補正の助けとなり，比較化と標準化のためのリファレンスをセットします。第三の要素は，CK20とPBGDの個別のPCRで決定される反応効率を，各計算で使用していることです。これは非効率なPCR反応のケースにおいてコントロールを提供します。

3種類のRNA濃度，3種類の逆転写，6種類のPCR反応を行った27回の複製サンプルを使用して，スタンダード曲線からのコピー数の測定と比較されたライトサイクラー 相対定量ソフトウェアにより，相対比が得られました（表1）。較正されたCK20相対比の変動係数はそれぞれ17％と22％であり，後者の大きなエラーはPCRランの間のスタンダードカーブにおける変動が導入されたからでした。PBGD定量とキャリブレーター比のファクターを入れないと，スタンダードカーブから得られたng RNAの絶対CK20コピー数からのエラーは40％でした。

表1：(1)ライトサイクラー相対定量ソフトウェアと(2)スタンダードカーブ法での定量計算の再現性比較。複数回測定の平均値±変動係数を表示。
(1)ライトサイクラー相対定量ソフトウェア
複数回測定されたRNA	CK20の交点	PBGDの交点	ng RNA当たりのCK20コピー数	較正されたCK20：PBGD
キャリブレーター	24.10±0.6%	25.73±0.5%	NA	1000000
1 ng（9）	27.8±0.5%	30.23±0.9%	NA	1769606±14%
10 ng（9）	24.99±1.3%	27.33±1.0%	NA	1698947±12%
100 ng（9）	22.48±0.4%	24.45±1.4%	NA	1321202±12%
トータル（27）			NA	1596585±17%
(2)スタンダードカーブ法
複数回測定されたRNA	CK20のコピー数	PBGDのコピー数	ng RNA当たりのCK20コピー数	較正されたCK20：PBGD
キャリブレーター	21 560±11%	2 598±11%	210±11%	1000000
1 ng（9）	1 759±11%	141±16%	1 729±11%	1556000±30%
10 ng（9）	12 026±22%	930±22%	1 203±11%	1578231±17%
100 ng（9）	65 762±17%	5 853±11%	658±11%	1350182±9%
トータル（27）			1 196±40%	1494804±22%

まとめ

この研究は，研究応用における微少転移の検出に価値のあるツールとなる，新しいライトサイクラー-CK20定量キットについて記述しています。このアッセイは，定量的で，迅速・簡便，柔軟，特異的，高感度であり，多検体のルーチン解析にも使用可能です。PCR定 量モデルが再現性を最大にするために使用され，研究室間の標準化のプラットフォームを提供します。このアッセイはより情報が得られる解析法で，微少転移検 出の研究間に存在する不一致の背後にある理由を解明する助けとなります。このような標準化されたラージスケール解析を可能とする定量アッセイは，バックグ ランド発現の閾値を決定と腫瘍測定の潜在的な重要性を評価する可能性に道を開き，更なる研究でこの可能性を明瞭にする必要が有ります。

LightCycler-HER2/neu DNA定量キット

－オンコロジー研究：これより簡単で正確なHER2/neu DNA定量はありません。

はじめに

ヒト上皮成長因子レセプター-2（HER2，またHER2/neu，c-erbB2とも）遺伝子は，染色体17q21にマップされるプロトオンコジーンです。これは185 kDの膜貫通形の糖タンパク質で，HER2/neuタンパク質あるいはレセプターと呼ばれています。HER2/neuはチロシンキナーゼファミリーのメンバーで，ヒト上皮成長因子レセプター(EGF-R)と高い相同性があります。HER2/neuの増幅あるいは/および過剰発現は，ヒトガンの広い範囲（胸部，卵巣，子宮内膜，子宮頚部，肺，胃，結腸，間葉，食道，膀胱，腎臓，頭部および頚部の偏平細胞，膵臓，唾液腺，胸腺のガン）でしばしば観察されます。

製品の記述

ライトサイクラー-HER2/neu DNA定量キットは，ライトサイクラー機器を使用してのキャピラリーガラス内でのPCR用に，特別に調整されています。HER2/neu遺伝子の112 bp断片と，ヒトゲノムDNAからのリファレンス遺伝子の133 bp断片が増幅されます。それと同時に，ハイブリダイゼーションプローブの2種類の特異的ペアにより，検出されます。

同時定量は，HER2/neu特異的オリゴの5’-末端にLC-Red 705，リファレンス遺伝子特異的オリゴの5’-末端にLC-Red 640をラベルすることで達成されました。以前に作成したカラー較正ファイルを用いて2色実験のデータを補正します。HER/neu DNA増幅レベルの決定には，新しいLC 相対定量ソフトウェアを使用します。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
LightCycler- HER2/neu DNA定量キット	3113922	32回反応	¥99,200
LightCycler色較正キット	2158850	1セット （5回反応）	¥16,000
ライトサイクラー 相対定量ソフトウェア	3158527	1パック	ご照会

MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）の評価

はじめに

純粋で完全なmRNAを大量に分離することは，組織特異的遺伝子発現のモニタリングにおいて大変重要で根本的な鍵となります。MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）は，MagNA Pure LC機器上での，1-10 mgの凍結組織からのmRNAの精製用にデザインされています。キットは192回のmRNA分離に必要なすべてのバッファー（表1）を含み，追加試薬は必要としません。このmRNAの分離法は磁性体粒子技術に基づいており，精製の初期ステップで試薬がヌクレアーゼを阻害しています。全自動プロセッシングとこれらの特徴の組み合わせにより，遺伝子発現分析などのすべてのダウンストリーム応用に要求される，高い収量と品質のDNAフリーのmRNAを得ることが出来ます。

表1：MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用） －キット内容と機能
試薬	機能
ビオチン標識Oligo(dT)プローブ	mRNAとOligo(dT)のハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションバッファー	Oligo(dT)の希釈
洗浄バッファーII	塩，タンパク質の除去
溶解バッファー	細胞溶解とヌクレアーゼの失活
DNase，RNaseフリー	DNAの消化
DNaseインキュベーションバッファー	DNaseの希釈
洗浄バッファーI	PCRインヒビターの除去
ストレプトアビジン磁性体粒子（SMPs）	Oligo(dT)/mRNA複合体の結合
溶出バッファー	純粋なmRNAの溶出

本キットでのmRNA分離の原理は，ビオチン標識Oligo(dT)とストレプトアビジンコート磁性体粒子（SMPs）の使用をベースとしています（図1）。最初に，マニュアルでの調製ステップ（サンプルの溶解と均質化）が行われます。後の精製ステップはMagNA Pure LC機器での使用に至適化されています。MagNA Pureのソフトウェアにインストールされている，組織からのmRNA分離に特異的なプロトコールを使用します。ソフトウェアは全試薬の必要量を自動的に計算し，セットアップ時に，必要な消耗品のタイプと数を表示します。

本キットで得られた最初の結果をここに示します。mRNAは様々なタイプと量の凍結マウス組織（1-10 mgの脾臓，肝臓，腎臓）から分離されました。mRNAの品質はRT-PCRでチェックし，DNAコンタミネーションの不在は，コントロールPCRで測定しました。mRNAの完全さと純度はノーザンブロット分析で評価しました。MagNA Pure LCシステムの再現性は，ライトサイクラーシステムでのRT-PCR分析でチェックしました。

材料と方法

MagNA Pure LCでの凍結マウス組織からのmRNA分離

→プレ分離ステップ
1-10 mgの凍結（－80℃）マウス肝臓のホモジナイズを溶解バッファーとホモジェナイザー（Ribolyser[Hybaid]，Ultra Turrax[IKA]あるいは乳鉢/乳棒/ニードル）を使用して行う。ビオチン標識Oligo(dT)を含むキャプチャーバッファーを加える。放出されたpoly(A+)テイルmRNAはOligo(dT)に特異的にハイブリダイズする。遠心後，ライセートの上澄みを回収し，MagNA Pure LCサンプルカートリッジの中へ移す。

→全自動mRNA分離
Oligo(dT)/mRNA複合体はストレプトアビジン磁性体粒子（SMPs）の表面に固相化される。ビーズ複合体はDNaseとインキュベートされ，DNAのコンタミネーションが除去される。SMPsは数回洗浄され，未結合の基質が除去される。最後に，mRNAはSMPsから溶出され，最終容量100μl中に回収される。

ライトサイクラーでのRT-PCRとコントロールPCR分析

核酸の分離後，MagNA Pure LC機器でRT-PCRとコントロールPCRをセットアップし，ライトサイクラーによるハイブリダイゼーションプローブフォーマットで，5μlの分離mRNA溶液と20μlの最終反応液量で，RT-PCRとコントロールPCRを行った。

ノーザンブロット分析

分離したmRNAをノーザンブロット分析に用いた。100μlの溶出mRNAからの7.5μlを，変性ゲル電気泳動で分離した後，ナイロンメンブレンにトランスファーし，β-アクチン転写DIG標識プローブと68℃でオーバーナイト，ハイブリダイズした。結果は，ルミ-イメージャーF1ワークステーションでモニターした。

結果

ノーザンブロット分析

MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）で単離したmRNAの重合度が，β-アクチン転写DIG標識プローブを使用したノーザンブロット分析で確認された。mRNAは，10 mgの様々なタイプの組織（マウス肝臓，脾臓，腎臓）から3種類のホモジェナイズ法（Ribolyser，Ultra Turrax，乳鉢/乳棒）で分離された。図のハイブリダイゼーションパターンは，各サンプルにおいて期待されるサイズ（1.8 kb）の明瞭なバンドを示した（図2）。ホモジェナイズ法としてRibolyserを使用して分離したmRNAサンプルは，他の方法より強いバンドを示した。これらの結果は，Ribolyserによるホモジナイズが，最も高いmRNA収量を得られることを示唆している。

ノーザンブロット分析は，MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）で単離したmRNAが分解しておらず，肝臓のような大量のヌクレアーゼ活性を持つ材料に応用しても，高い重合度を持つことを明瞭に表している。この事は，キットの試薬が精製過程の大変早い時機にヌクレアーゼを阻害しているという，特別の効率を示している。

スケールアップ実験

開始材料のスケールによる再現性におけるMagNA Pure LCの性能が，Ribolyserホモジェナイズ法を使用して，様々な量のマウス組織（脾臓と肝臓）からのmRNAの分離でチェックされた。分離されたmRNAは，ライトサイクラー機器での1ステップRT-PCRによる，サイクロフィリンA転写産物の増幅に使用された。RT-PCRの結果を図3と4に示す。両方の組織タイプで，RT-PCRのグラフは通常の推移を示し，交点の分析はそれぞれ相関係数0.97と0.99の直線パターンを見せた。両者の結果とも，開始材料の量の差異を反映している。これらの結果は，本キットでの核酸の精製量は，開始材料の量と緊密に相関することを示唆している。これは，遺伝子発現の研究において，最も基礎的に要求されるものの一つである。

DNAのコンタミネーション試験

mRNAが様々な量のマウス組織（脾臓と肝臓）から，ホモジェナイズ法としてRobolyserを使用して分離され，DNAコンタミネーションの可能性をチェックするため，サイクロフィリンAの遺伝子が増幅された。RTステップを含まないコントロールPCRを，脾臓と肝臓から精製したmRNAに対して行った（図5）。ライトサイクラーのグラフはフラットな線示しており，mRNAにおけるDNAの不含が確認された。これらの結果から，本キットでの分離mRNAの高品質性が確認された。正確な遺伝子発現における定量RT-PCRは，DNA-フリーのmRNAに実際に依存している。

アッセイ間の変動分析

15 x 10 mgの肝臓からmRNAが分離され，ターゲットとしてサイクロフィリンAの転写産物を使用してRT-PCRで分析した。機器の変動（ライトサイクラーやMagNA Pure LC）を避けるために，15本の単一の溶出物と，溶出物をプールしたもの15本を分析した（図6）。

交点の変動係数(CV)は常に3％以下であり，単一溶出物では2.59％，プール溶出物では2.71％であった。

これは本キットと機器の再現性の高さを物語っており，変動が分析システムに起因しないことが確認された。

結論

MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）のMagNA Pure LC機器での性能がこの記事で述べられました。mRNAは凍結マウス組織の様々な量とタイプ（1-10 mgの脾臓，肝臓，腎臓）より分離されました。様々なテストを使用しての分離mRNAの分析は，応用された精製過程が，高品質で，出発材料を反映した量での核酸の精製を行っていることが示唆されました。分離されたmRNAは効率的なDNase分解ステップによりDNAフリーでした。凍結組織から精製されたmRNAの性能が，この機器とキットの組み合わせを，遺伝子発現分析の分野における正確で信頼性の高いツールとします。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
MagNA Pure LC機器	2236931	1台	ご照会
MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキットII（組織用）	3172627	1キット （192回反応）	¥85,000

詳細は →http://biochem.roche.com/magnapure