Lumi-Imager F1ワークステーションによるcDNAアレイのNon-RIハイブリダイゼーションと検出

Tips & Facts

アレイの実験的アプリケーション は、ここ数年の経験しかありません。しかし、ヒトゲノムプロジェクトやその他の多くのプロジェクトの出現により、大変にポピュラーになりました。アレイは 最初、ナイロンメンブレン上で行われ、最近ではガラススライドに適用されました。このプロトコールはDIGケミリンクにより標識されたmRNAプローブを使用し、メンブレン上にスポットされた、様々な遺伝子を表すPCR産物のハイブリダイゼーションのために開発されました。

mRNAプールの直接標識は非常に高感度で、cDNAプローブを使用するより優れています。すべてのcDNAプローブの欠点は、mRNAプールには存在する、すべてのシークェンスがcDNAプローブ中に明瞭に現れているかを保証しない点です。mRNAの二次構造は、cDNA合成の完全合成における、主要な障害です。ケミリンクテクノロジーは、cDNA調製の必要のない、mRNAの直接標識のための最初のツールです。DIGケミリングは、酵素の関与しない、化学的な標識法です。DIGはシスプラチン複合体を通じて、AあるいはGのN7部位に附加されます。標識核酸はボイリングによる変性に安定で、すべてのハイブリダイゼーション応用に使用する事ができます。下の表は、Lumi-Imager F1を使用してのcDNAアレイのNon-RIハイブリダイゼーションと検出のための製品を示しています。

このレポートの詳細は、http://biochem.roche.com/dig中のDIG System Basics/Special Applications: cDNA arrayをご覧ください。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
DIGケミリンク ラベリング＆デテクションセット	1836463	1セット （50μg DNA/RNA）	¥35,400
RNA(酵母)	109223	100 g	¥6,400
アクチンRNAプローブ	1498045	2μg	¥38,500
DIGイージーハイブ、顆粒	1796895	6 x 100 ml分	¥31,500
DIGイージーハイブ	1603558	500 ml	¥26,500
DIG洗浄＆ブロックバッファーセット	1585762	1セット （30ブロット）	¥25,800
AP標識抗DIG、Fabフラグメント	1093274	150 U	¥18,500
CDP-Star、化学発光基質 （ready-to-use）	2041677	2 x 50 ml	¥33,000
20 x SSC	1666681	4 L	¥20,900
Lumi-Imager F1ユニット	1901800	1台	ご照会
mRNAアイソレーションキット	1741985	1キット	¥32,400
ハイブリダイゼーションバッグ	1666649	50バッグ	¥5,400

アポトーシス検出ツール－簡便さと高い信頼性

アポトーシスは現在もっともホットな研究分野で、この5年で30,000以上の論文が発表されています。AIDS、脈管障害、神経変性や骨粗鬆症は、研究者が病理学的な機構やプログラムされた細胞死の解明について興味を持つ疾患の例です。

アポトーシス研究は、次の2つの幅広い部門に分類されます。

▲DNAの断片化などの、アポトーシス過程の既知の兆候を導く、いくつもの複雑なシグナルパスウェイを説明しようとする研究作業。

▲ある状況でのプログラムされた細胞死のインパクトに注目し、検出や定量化、調節に主眼を置く研究作業。

第1の研究エリアは、酵素学、タンパク質の相互作用、遺伝子や遺伝子発現分析などを測定する基礎的なツールを必要としますが、第2の研究エリアはアポトーシス研究の信頼できるアッセイ法に強く依存します。

ルーチンでのアポトーシス検出用アッセイ

あるタイプのガンが正常なアポトーシス機構の損傷に関連しているか、in vitroの細胞モデル系で観察されるアポトーシスの誘導がある種の薬剤で調節されるかという疑問には、アポトーシス検出ツールにより答えが出ます。これらの検出ツールは上記の第2の研究エリアで重要なアッセイ法です。その例としては以下のものがあります。

▲DNAの断片化の検出－In SituあるいはELISAシステムを使用して

▲カスパーゼ活性の検出－組織切片やマイクロタイタープレートに基づくアッセイ系を用いて

▲蛍光顕微鏡での、細胞調製品上のホスファチジルセリン露曝の検出や、FACS分析による半定量的アプローチ

▲ルーチン研究のための簡便で高品質なアッセイ法を用いてのアポトーシス検出

上記に述べた方法は、アポトーシスの検出と定量における信頼性のある結果を得るための、現在では標準となった技術を代表しています。理想的には、2種類か3種類のアポトーシス検出法の使用が、モデル系におけるアポトーシスイベントの評価、並びに調節研究やスクリーニング実験のための基礎を確立するための一助となります。

処理するサンプル数が非常に多い時、DNAフラグメンテーションのためのマイクロタイタープレートに基づくアッセイ(Cell Death Detection ELISA^PLUS)や、カスパーゼ活性を検出するためのアッセイ（ホモジニアス カスパーゼアッセイやカスパーゼ3活性アッセイ）が、実際的な解決をもたらす方法です（図1）。

単一細胞レベルでのアポトーシス検出は、第2の細胞表面分子と組み合わせての、顕微鏡技術やFACS分析を必要とします。これらの技術はIn SituCell Death検出アッセイに適用する事ができます－DNA鎖の崩壊を報告する、十分に確立されたTUNEL法の使用（図2）。4種類のキットが入手可能で、研究者の様々なアプリケーションや要求を満たすように、2種類は赤及び緑色の蛍光染色用（FACS分析にも最適）、後の2種類はPODやAPによる免疫組織学的検出用です。

アネキシンVはアポトーシスの別の証拠、インタクトな細胞膜の膜外へのホスファチジルセリンの露曝の検出に使用されます。アネキシンV-FLUOSあるいはアネキシンV-Alexaは共にFACSや蛍光顕微鏡で使用でき、個々のサンプル研究におけるセットアップにわずかな時間しか必要とせず、細胞集団のアポトーシスの存在/不在が迅速に検出できる技術です（図3）。

→詳細はインターネットで！！→http://biochem.roche.com/apoptosis

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
カスパーゼ3活性アッセイ ホモジニアス カスパーゼアッセイ	2012952 3005372 2236869	96テスト 100/400テスト 1000/4000テスト	¥97,800 ¥40,600 ¥234,000
アネキシンV-Alexa 568 アネキシンV-ビオチン アネキシンV-FLUOS アネキシンV-FLUOS染色キット	1985485 1828690 1828681 1858777 1988549	250テスト 250テスト 250テスト 50テスト 250テスト	¥80,100 ¥76,400 ¥76,400 ¥33,300 ¥100,500
Cell Death Detection ELISAPLUS In Situ Cell Death Detection Kit, AP In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein In Situ Cell Death Detection Kit, POD In Situ Cell Death Detection Kit, TMR-Red	1774425 1920685 1684809 1684795 1684817 2156792	96テスト 960テスト 50テスト 50テスト 50テスト 50テスト	¥54,600 ¥371,300 ¥64,300 ¥60,000 ¥64,300 ¥57,700

日本版ホームページも完全リニューアル

機器の充実や、2000/2001年研究試薬・機器カタログの発刊に伴い、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社の日本版ホームページも完全リニューアルしました。バイオケミカニュースバックナンバー、Lumi-Imager F1、LightCycler、FAQs、キャンペーン情報、プレゼント情報、フォーラム、資料請求フォームなど、有用な情報が目白押しです。ぜひ、http://www.rdj.co.jp/bioche/index.htmを訪問して下さい。

　

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