ロシュ・ダイアグノスティックスでは、画期的なタンパク質発現システムであるRTS 500(Rapid Translation System)を新発売致します。

RTS500コントロールユニットと試薬キット(本体サイズ：710(W) x 260(D) x260(H) mm)

この数年間の世界的なゲノムプロジェクトのめざましい発展により、研究対象が遺伝子自身の解析から遺伝子産物の生理学的役割の解明へとシフトしつつあります。これに伴い新たに発見された"Open reading frame"の機能を解明するために、そのcDNA部分から、迅速かつ簡便にタンパク質を合成（発現）する必要性が出てきています。
しかしながら、これまではこの要望に答えるユニバーサルな方法はありませんでした。今まで使用されています細胞培養法は時間がかかり、様々な問題を抱えて います。例えば、"封入体（インクルージョンボディー）"、"発現産物の細胞毒性"、"発現産物の分解"等です。また、現在までの"セルフリー "システムの場合、その収量の少なさが問題とされてきました。
このロシュ・ダイアグノスティックス開発の、新しいRTS500 (Rapid Translation System)は、近年の研究者の様々なニーズを満たした最初の"セルフリー"システムです。またこのシステムはオープンシステムなので、今までの細胞培 養法が抱えていた様々な問題、制約に対する新しい解決手段となります。

RTS500の構成

このシステムは試薬キットとコントロールユニットから構成されています。

（1）	RTS500 E.coli, circular template - E.coli lysate（凍結乾燥品） - Reaction Mix（凍結乾燥品） - Feeding Mix (凍結乾燥品) - Energy Mix (凍結乾燥品) - 再溶解バッファー - GFPコントロールベクター - クローニングベクター - 反応容器（2本のスターラーバー含む）
（2）	コントロールユニット RTS500システムには専用に開発された機器が用意されており、ターゲットタンパク質に応じた最適条件(攪拌スピード、反応温度、反応時間の設定)で反 応を行う事が出来ます。発現反応終了後は、タンパク質の保護のために自動的に温度を下げる機能が付加されています。

RTSコントロールユニットの特長

- 反応温度：20 - 40℃
- 攪拌スピード：0 - 360 rpm
- 反応時間のプログラム設定
- 反応後の自動クールダウン

反応のセットアップ

ステップ1：	E.coli lysate, Reaction Mix, Feeding Mix, Energy Mixを再溶解バッファーで溶解。
ステップ2：	10.5 mlのFeeding Mix、0.5 mlのEnergy Mixから供給溶液を調製。
ステップ3：	反応溶液の調製 0.25 ml E.coli Lysate 0.75 ml Reaction Mix 0.05 ml Energy Mix 3-15μgテンプレートDNA(またはコントロールベクター GFP ）
ステップ4：	"反応槽"に反応溶液を入れる。
ステップ5：	"供給槽"に供給溶液を入れる。
ステップ6：	RTS500コントロールユニットに容器をセットし、パラメーター(反応温度、攪拌スピード、反応時間)をセットする。

RTS500の原理

Rapid Translation System RTS500の原理は、反応溶液中でトランスクリプションとトランスレーションとをカップリングさせたものです。このシステムの重要なポイントは反応に必 要な基質とエネルギーを、半透膜を介して連続的に供給できる事です(図1)。これはCECFシステム(Continuous Exchange Cell Free)と呼ばれ、これを用いる事によって、タンパク質合成の反応時間を最長24時間まで行う事が可能となります。

図1.トランスクリプション/トランスレーションのカップリング反応。

RTS500の特長

◆高い収量(例：コントロールGFPで500μg/24時間)
◆高い再現性
◆ 細胞培養を必要としない利便性
◆ 細胞毒性のあるタンパク質の合成
◆ 複合タンパク質の同時発現
これらの特長は従来の"セルフリー"でのバッチ法と比較した場合でも明らかな利点になっています。

トランスクリプション/トランスレーション反応

　このシステムに使用される専用の反応容器は、半透膜で２つに区切られているユニークな構造を持っています(図2)。
"反応槽"部分では、ターゲット遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとして、T7 RNA ポリメラーゼによって高レベルのトランスクリプションが行われます。また、ここにはE.coliライゼート成分(tRNA、リボソーム等のトランスレーションに必要な成分)が含まれていますので、これを用いてトランスレーション反応が行われます。
"供給槽"にはイオン、エネルギーとなる基質、ヌクレオチド、アミノ酸が含まれており、半透膜を介してこれらの物質を反応槽に供給します。反応槽から供給 槽への対流はまた、反応槽中で生成した阻害要因となる低分子を効果的に希釈します。この原理によって、反応溶液１ mlで最大500μｇのターゲットタンパク質を、最長24時間で発現させる事が可能です。

セルフリー環境で、エネルギー源の連続供給により迅速かつ大量のタンパク質を発現するシステム。

図2. CECF (Continuous Exchange Cell Free)システム概念図

RTS500のクローニングベクター

　pIVEXシリーズは多様な原核生物用の発現ベクターです。このベクターはT7プロモーター、リボソームバインディングサイト (RBS)、トランスレーション開始コドン(ATG)、制限酵素認識部位のNco IとSma I、またはマルチクローニングサイト(MCS)、T7ターミネーターが含まれています。使用するクローニングベクターの選択が、タンパク質発現に極端に依 存する場合があります。これは使用ベクターの種類により転写されたｍRNAが、トランスレーションされにくい高次構造を取る可能性があるためです。キット 内には、最適なベクターが選べるように数種類のベクターが含まれています。
また、これらのベクターにはN末端、C末端にタグ配列も含まれており、ターゲットタンパク質を簡便に精製する事が可能となっています。

図3. キット内に供給されるクローニングベクター

アプリケーションデータ

　RTS500システムでは20-1000μgスケールの様々なタンパク質の発現が成功しています。多くのタンパク質発現は30℃で行われており、最長24時間まで反応時間を行う事で収量を増加させる事が出来ます(図4)。

	図4. 機能活性を持つGFPの発現。 異なる温度と時間での生産性の確認において至適温度は30℃、24時間で500-800μgのGFPが得られた。

モデルタンパク質のCATを発現させ、SDS-PAGEを行いクマシー染色で検出しています。レーン4-5はStrep-Tagを使用しワンステップで簡便に精製を行った後、泳動されています(図5)

図5. Strep-Tagを利用したCATタンパク質の精製。Strep-Tag-CAT(26.8 kD)のSDS-PAGE分析。 　レーン1: 未精製反応産物 レーン2: 流出分画 レーン3: 洗浄分画 レーン4-6: ストレプトアクチン アフィニティカラム精製後の溶出分画。

同一反応でGFPとCATを同時に発現した例です。これは同時に複数のタンパク質が、効果的に発現される可能性を示しています(図6)。

図6. His-Tag GFP(28.2 kD)とCAT(26.8 kD)の同時発現のSDS-PAGE分析。 　レーン1: スタンダード レーン2:未精製トランスレーション産物 レーン3: 流出分画、レーン4-6: 洗浄分画 レーン7-9: Ni-NTAアフィニティカラム精製後の溶出分画。

細胞毒性を持つタンパク質のMID1を、RTS500を使用して発現する事が出来ています。このタンパク質はこれまで原核生物、真核生物での発現はうまく出来なかったものです(図7)。

図7. 毒性タンパク質MIDI発現のウェスタンブロット分析。 レーン1: 陰性コントロール(発現ベクターを用いず反応) レーン2: 未精製反応産物(20時間後) レーン3-5: ストレプトアクチン アフィニティカラム精製後の溶出分画

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
RTS500 コントロールユニット	3064859	1台	\70,000
RTS500 E.coli(環状テンプレート用)	3018008	1 kit	\128,000

 
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