ＤＩＧ標識ＰＣＲプローブによる心筋生検のノーザンブロット分析

アブストラクト

ノーザンブロットでのｍRNA同定における簡便なNon-RI法確定するため、化学発光検出と組み合わせて、ＰＣＲによるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識 ｃＤＮＡをプローブとして使用した。ｃＤＮＡは、少量の心筋生検中に存在する、数種のｍＲＮＡに対するプローブとしてデザインされた。トータル ＲＮＡ（５-１０μｇ）をゲルにアプライし、＋チャージのナイロンメンブレンにブロットした。メンブレンを２５-２００ｎｇ／mlのＤＩＧ標識プローブと ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリッドをＣＳＰＤで化学発光検出した。定量分析はＮＩＧイメージ１．６ソフトウェアで行い、 ２８Ｓ遺伝子の発現で結果を標準化した。

はじめに

特定のｍRNAの同定は通常、³²P標識ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによるノーザンブロット分析で行わ れます。数々のＮｏｎ-ＲＩ法が、拡散のブロッティングのために開発されています。ここでの研究の目的は、少量の心筋生検での遺伝子発現の分析に、高感度 で半定量性のあるＮｏｎ-ＲＩ法を開発することです。我々はここで、ｃＤＮＡプローブをＰＣＲでＤＩＧ標識し、ノーザンブロットで心房性ナトリウム利尿因 子（ＡＮＦ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、熱ショックプロテイン（ＨＳＰ）遺伝子を分析した方法を報告します。結果の標準化には、２８Ｓ遺伝子 の発現が用いられました。

材料と方法
ＲＮＡの抽出

トータルＲＮＡは心筋生検から、Chomczynski と Sacchi の開発したワンステップＲＮＡ分離法を改良した TriPure アイソレーション試薬により分離された。分離されたトータルＲＮＡは分光光度計で定量され、２００ｎｇ／μｌの濃度に希釈された。異なるＲＮＡサンプルの 希釈物を１本にプールした。
ノーザンブロット分析では、５-１０μｇのトータルＲＮＡを変性条件の１．５％アガロースゲルで分離し、＋チャージナイロンメンブレンにブロットした。ＵＶクロスリンクを行った後、トランスファーが完全であることを確認した。

プローブのラベル

２００ｎｇ／μｌのＲＮＡプールよりｃＤＮＡを逆転写し、次に Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにより増幅した。逆転写はターゲット配列に特異的なプライマーを用いて、４２℃で１時間行った。ＰＣＲ条件はそれぞれのターゲット遺伝 子毎に調節した。ＰＣＲの間にｃＤＮＡプローブはＤＩＧ-１１－ｄＵＴＰの取り込みにより標識される。ＰＣＲ断片を６％アクリルアミドゲル電気泳動都銀染 色で確認した後、ゲルから溶出した。その後、高純度エタノール沈殿を行った。

ＤＩＧ-ｃＤＮＡの収量検定

ＤＩＧ-ｃＤＮＡをＤＮＡ希釈バッファーで２００倍に希釈し、１μｌのサンプルと１μｌの標識コントロールＤＮＡをナイロンメンブレンにスポットする。 ＣＳＰＤ基質を用いて検出し、スポットをデンシトメーター分析（ＮＩＨイメージ１．６ソフトウェア）で定量する。サンプルと標識コントロールの比により標 識物の収量が検定できる。

ハイブリダイセーションと定量

ＤＩＧイージーハイブあるいは５０％フォルムアミドを含む標準バッファー中で４２℃、２時間プレハイブリダイゼーションした後、１００ｃｍ²当 たり６ｍｌのＤＩＧイージーハイブあるいは５０％フォルムアミドを含む標準バッファー中で４２℃、オーバーナイトでハイブリダイゼーションを行う。ＤＩＧ 標識ｃＤＮＡプローブは２５ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌ濃度域で使用した。フィルターはＣＳＰＤ基質で検出し、定量分析はＮＩＨイメージ１．６ソフト ウェアで行った。

図1. ＤＩＧ標識プローブでのヒトｍＲＮＡの検出。 　ＡＮＦとＢＮＰのｍＲＮＡ；ヒト右心房より１０μｇ。 　レーン１： ヒト右心房より３０μｇ。 　レーン２： ヒト右心室より５μｇ。 　レーン３： ヒト右心室より１０μｇ。

結論

ＰＣＲ間のＤＩＧ-１１-ｄＵＴＰの取り込みは、ｃＤＮＡの標識において大変簡単な操作法である。プローブは大変高感度で高収量であった。少量の心筋生検からの少コピー数のＲＮＡをノーザンブロット分析する事は、ＲＩを使用しなくても可能となった。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
ＴｒｉＰｕｒｅアイソレーション試薬	1667157	50 ml	¥19,400
	1667165	200 ml	¥64,400
ナイロンメンブレン、＋チャージ	1209299	20枚(10x15cm）	¥24,200
	1209272	10枚(20x30cm）	¥48,500
	1417240	1ﾛｰﾙ(0.3x3m)	¥61,500
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５units/μｌ	1146165	100 units	¥7,700
	1145173	500 units	¥33,800
	1418432	4x250 units	¥63,000
	1596594	10x250 units	¥146,300
	1435094	20x250 units	¥279,000
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１units/μｌ	1647679	250 units	¥17,100
	1547687	4x250 units	¥63,000
Ａｎｔｉ-ＤＩＧ-ＡＰ	1093274	150U(200μl)	¥18,500
ＤＩＧ-１１-ｄＵＴＰ、アルカリ不安定	1573152	25 nmol	¥28,500
	1573179	125 nmol	¥94,000
ＤＩＧ-１１-ｄＵＴＰ、アルカリ安定	1093088	25 nmol	¥28,500
	1558706	125 nmol	¥94,000
	1570013	5x125 nmol	¥366,200
ＤＩＧ ＤＮＡラベリングミックス	1277065	50μl(25反応）	¥20,300
ＤＩＧ標識コントロールＤＮＡ	1585738	50μl	¥10,500
ＣＳＰＤ	1655884	1 ml	¥30,900
ＤＩＧ イージーハイブ	1603558	500 ml	¥26,500
ＤＩＧ イージーハイブ、顆粒	1796895	1 set	¥31,500

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ＨａＣａＴ細胞培養におけるアポトーシス誘導剤としてのベツリン酸 　

アブストラクト

プログラムされた細胞死（アポトーシス）のイベントの順序、トリガーや調節の研究は、成長や分化、組織構造の再生の生理学的過程におけるアポトーシスの 中心的な役割のため、医学における様々な質問に答えるために、益々その重要性を増している。アポトーシス機構の研究は、ウイルス感染の尿理学や自己免疫疾 患、腫瘍の発育における我々の知識を大いに飛躍させた。ここでは、新規のM３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨ抗体を用いて、アネキシンVとAPO２．７の比較を報告する。ベツリン酸を、ヒトケラチノサイト細胞株ＨｅＣａＴにおけるアポトーシス の誘導剤として用いた。

はじめに

アポトーシスの過程はいくつかの方法で、細胞内で検出できます。フローサイトメトリーは多くの細胞を個別に、しかも迅速に分析できるために、非常な優位 性を持っています。アポトーシスサイクルの後期のイベントと考えられているＤＮＡの断片化を測定するために、ＴＵＮＥＬ法がしばしばフローサイトメトリー で使用されます。アネキシンＶ／プロピディウム イオダイド（ＰＩ）染色は初期のアポトーシス過程の検出において、迅速で簡便な方法を提供します。アポトーシスの初期において細胞膜はまだ無傷ですが、ア ネキシンＶが特異的に結合するホスファチジルセリン（ＰＳ）は、膜の外部に転座しています。他のアポトーシスマーカーは３８ｋＤのＡＰＯ２．７タンパク質 で、アポトーシスの条件下、ミトコンドリアの膜に発現します。
細胞にアポトーシスを誘導した際に初期に起こる変化の内の一つは、カスパーゼの活性化です。カスパーゼはザイモゲンとして存在し、多くのプレアポトーシ スシグナルにより活性化されます。これらカスパーゼの標的部位の一つがサイトケラチン１８（ＣＫ１８）です。Ｍ３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨ抗体は、天然のＣＫ１８では検出されないカスパーゼ切断部位に結合します。それゆえ、大変初期の段階でアポトーシス過程を検出できま す。
ベツリン酸は天然に広く存在するトリテルペノイドで、悪性メラノーマや神経皮由来腫瘍に、特異な形状のアポトーシスを引き起こす事が述べられています。 ここでは、このモデル物質がケラチノサイトにおいても、カスパーゼの活性化に基づくアポトーシスを引き起こすかどうかを研究します。

材料と方法
細胞培養とアポトーシスの誘導

ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）を、ウシ下垂体エキストラクト（２５μg/ml）、ｒＥＧＦ（０．１-０．２ng/ml）、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを含む無血清培地で３６．６℃、湿度９８％及び５％ ＣＯ₂濃度で培養した。
細胞は５ｍｌの培養ボトルで３日間培養し、０，４，８，１２，１６ mg/ml のベツリン酸で１５時間および２４時間インキュベートした。

アポトーシスの検出

それぞれの培養調製品をM３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨ、アネキシンＶ-ＦＩＴＣ、ＡＰＯ２．７抗体で同時に調製した。培養細胞は２検体ずつ調製した。サンプルをフローサイトメトリーで測定し、結果をＷｉｎＭＤＩプログラムで評価した。

結果

アポトーシスの誘導のために、ＨａＣａＴケラチノサイトを４-１６μg/mlの範囲のベツリン酸とミックスした。細胞の明瞭な形態学的変化は、８μg/ml濃度からの添加で、１５時間からすでに観察された。
カスパーゼの活性化やミトコンドリアでのＡＰＯ２．７の存在、及びホスファチジルセリンの転座を含む測定したすべてのパラメータは４μg/mlで多くの陽性細胞で増加した。
M３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨを用いて測定されたカスパーゼ活性は、１５時間後の陽性細胞で４-５倍増加し、ベツリン酸濃度を増やしてもカスパーゼ陽性細胞が更に増える事はなかった。２４時間のインキュベーション後もまだ高いカスバーゼ活性が識別できた。
APO２．７の検出は使用したベツリン酸濃度と明瞭に相関し、２４時間処理後多くのAPO２．７陽性細胞が増加した。
アネキシン試験の評価は、濃度に従い陽性細胞数が相関的に増加した。この細胞のダメージは、アポトーシスの後期とネクローシスの双方に関係するが、明瞭な区別は不可能な事に注意。

ディスカッション

最初に注目すべき発見は、すべての方法が４μg/mlのベツリン酸のインキュベーションでも、ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）へのアポトーシスの誘導 を検出できた事です。この濃度での、M３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨにより、測定されたカスパーゼ活性化は、コントロースに比較してカスパーゼ陽性細胞で明瞭な増加を示し、アネキシンＶよる転座やミトコ ンドリアでのＡＰＯ２．７の発現よりも検出が可能でした。ベツリン酸の濃度を上げてもカスパーゼ活性はこれ以上十分に増加しませんが、低濃度のベツリン酸 で他の二つのアポトーシスマーカーより強く、４-５倍増加する事により、カスパーゼの活性化がアポトーシス過程で起こる最初のイベントである事を示してい ます。
アネキシンVは非常に簡便な方法ですが、後期のアポトーシスとネクローシスを区別する事が直接できず、区別するための他の検出ステップを加える必要があ ります。ＡＰＯ２．７は現在のところ、ミトコンドリアで特異的に起こる過程を記録するためには良い方法です。M３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨの明確な利点は、初期のアポトーシス過程の特徴であるカスパーゼのインターフェースを検出できる事です。それゆえこの方法は、アポトー シスの誘導に付随する問題を解決するために、特に適していると考えられます。

図１．ベツリン酸（４-１６μg/ml）添加１５時間後の、Ｍ３０-陽性ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）。 細胞はM３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨのインストラクションに従い調製し、フローサイトメトリーで測定。

図２． ベツリン酸（４-１６μg/ml）添加１５時間後の、ＡＰＯ２．７-陽性ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）。 細胞はメーカーのインストラクションに従い調製し、フローサイトメトリーで測定。

図３．ベツリン酸（４-１６μg/ml）添加１５時間後の、アネキシンＶ-陽性ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）。 細胞はメーカーのインストラクションに従い調製し、フローサイトメトリーで測定。

Order INFO

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
M３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨ	2140322	50テスト	¥27,400
	2140349	250テスト	¥73,500
アネキシン-Ｖ 染色キット	1858777	50テスト	¥33,300
アネキシン-Ｖ-ＦＬＵＯＳ	1828681	250テスト	¥76,400
アネキシン-Ｖ-ビオチン	1828690	250テスト	¥76,400
アネキシン-Ｖ-Ａｌｅｘａ ５６８	1985485	250テスト	¥80,100

 

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