ホットスタートPCRへの新たなる回答－ファストスタート Taq DNAポリメラーゼ

ファストスタート Taq DNAポリメラーゼは次世代のホットスタートPCRテクノロジーです。ファストスタートの名前は、活性化にわずか2分しか必要としない事から来ています。 化学的に修飾されたTaq DNAポリメラーゼは、PCRのセットアップ中から最初の変性ステップまでは不活化されていますので、非特異的なプライマーハイブリッドを伸長させる事が 無いため、PCRの特異性、感度、収量を劇的に改善します。また今までのホットスタートPCR酵素に対して次の利点を持っています。

特長

•  高い特異性、感度、収量で3 KbまでのゲノムDNA、cDNAを増幅します。
•  酵素は75℃まで活性を持たず、95℃、2分間で活性化されます。シングルコピーのターゲットも増幅可能です。
•  マルチプレックスPCRが可能です。
•  二次構造やGC-richなテンプレートも増幅できます(GC-rich溶液添付)。
•  キャリーオーバーの防止システムにも使用できます。
•  室温で扱えるため、全自動PCRへの応用が容易です。
•  50μlの反応系において、1ユニットで十分です。

MWM	Fast Start Taq	Fast Start Taq	ｻﾌﾟﾗｲｱｰA	ｻﾌﾟﾗｲｱｰA	ｻﾌﾟﾗｲｱｰB	Taq	MWM
VI		GC Rich Solution		+専用ﾊﾞｯﾌｧｰ		Roche	VI

図1. 200 ngのヒトゲノムDNA中の、 Apo E遺伝子よりのGC-richフラグメント(284 bp、74% GC含量)の増幅。 ロシュ・ダイアグノスティックスのファストスタート Taq DNAポリメラーゼと添付のGC-rich溶液の組み合わせが、最も優れた結果を示した。

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
ファストスタート Taq DNA ポリメラーゼ	2011468	50 units	¥7,000
	2032902	100 units	¥13,500
	2032929	500 units	¥55,000
	2032937	1000 units	¥101,500
	2032945	2500 units	¥226,000
	2032953	5000 units	¥385,000
PCR ヌクレオチドミックス	1581295	100回反応	¥5,300
	1814362	500回反応	¥23,600
PCR ヌクレオチドミックスPLUS	1888412	2x100μl	¥7,200
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、熱不安定	1775367	100 units	¥21,500
	1775375	500 units	¥80,900

トランスフェクションの新しい潮流－X-tremeGENE Q2

もしあたなが、HeLa、K562、Jurkat細胞のトランスフェクションをお考えなら、X-tremeGENE Q2を使用して下さい。現在までのところ、この3種の細胞のトランスフェクションに関しては、低効率で低いタクパク質発現レベルのトランスフェクション試 薬しか存在しませんでした。X-tremeGENE Q2こそ、この3種類の細胞でのトランスフェクションとが告げんに至適化した、新世代のトランスフェクション試薬です。3種類の細胞においては、 DNA：X-tremeGENE Q2の混合化、細胞当たりのDNA量などが異なりますが、インストラクションマニュアルには、この3種の細胞に至適化された操作法が、それぞれ記載されて います。

セット内容

成分	0.4ml包装	1.8ml包装
乾燥リピッドフィルム	0.4ml分	1.8ml分
再水酸化バッファー	0.4ml	1.8ml
DNA希釈バッファー	1ボトル、4ml	2ボトル、各3ml

乾燥リピッドフィルムを再水酸化バッファーに入れるだけでトランフェクション試薬の調整は完了します。後は、細胞毎に下記の無血清培地や血清入りの培地を用意するだけです。

細胞株	SFM	SCM 1*	SCM 2**
HeLa	F12K+G+P	F12K+10%FBS+G+P	F12K+20%FBS+G+P
K562	RPMI1640+G+P	RMPI1640+10%FBS+G+P	RMPI1640+20%FBS+G+P
Jurkat	RPMI1640+G+P	RPMI1640+10%FBS+G+P	RMPI1640+20%FBS+G+P

^*トランスフェクション前の日
^**トランスフェクションの当日
FBS=Fetal Bovine Serum
G=2mM L-グルタミン
P=1mM ピリルビン酸ナトリウム

図１．K562細胞におけるβ-Galの発現での、DNA：X-tremeGENE Q2の容量を帰ることによる効率の変化。 トランスフェクションの日に96ウェルプレートに蒔かれた2x104細胞を、トランスフェクション試薬／発現ベクターX-tremeGENE pM1 β-Galの容量を増やしながらトランスフェクトした。 DNA ：試薬の混合比は１：２を保持した。細胞のみ、あるいはDNAを含まない試薬のみを細胞に加えたものを、陰性コントロールとした。方法はインストラクション通り。

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
ファストスタート Taq DNA ポリメラーゼ	3045595	0.4ml(100回）	¥19,500
	3036421	1.8ml(100回）	¥65,000

ホモジニアス カスパーゼアッセイ－アポトーシスのハイスループットスクリーニング

ロシュ・ダイアグノスティックスではカスパーゼ活性の、初のシングルステップアッセイキットを販売いたします。このホモジニア スアッセイにおいて、基質の分解がもたらす傾向を測定することにより、カスパーゼ活性が測定されます。最も重要なカスパー ゼ,2,3,6,7,8,9,10 がこのアッセイで分析できます。この測定は高感度で、ヒト及び動物細胞102-104個の範囲で高い再現性があります。そのため、細胞内の活性化カスパー ゼの定量と同様に、カスパーゼのインヒビターのスクリーニングに使用できます。

アポトーシスでのカスパーゼの役割

多くのアポトーシスアッセイ法は、アポトーシスパスウェイのかなり後期に起こるイベントである核の崩壊、クロマチンの凝集、リーキーな原形質膜の発展などに基づいています。
特異的なプロテアーゼのグループである、カスパーゼ（cystein-as-partic acid proteases）の活性化は最も早いアポトーシスイベントの一つです。これらカスパーゼは不活型前駆体（プロエンザイム）として合成され、自己触媒や 他のプロテアーゼにより活性化されます。アポトーシスのもっとも重要なトランスデューサーであるカスパーゼは、特異的な構造、調節、およびＤＮＡ修復タン パク質を分解することにより、細胞の崩壊をイニシエートします。詳しくはロシュ・ダイアグノスティックスのアポトーシスウェブサイト（http://biochem.roche.com/appotosis）を訪問して下さい。

アッセイの特長

• カスパーゼ活性の定量的測定
• 培養細胞及びリコンビナントのカスパーゼの測定
• 高感度
• ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に至適化

典型的結果

図１は９６ウェルプレートでの、Ｕ937細胞内のカスパーゼ活性化により誘導されるローダミンの遊離を示しています。

図１．U937細胞内のカスパーゼ活性化により誘導されるローダミンの遊離。 ウェル毎に異なる濃度のU937細胞を３７℃で、４μg/mlのカンプトテシン露曝した。細胞を９６ウェルプレートでインキュベートした４時間後、細胞を 基質溶液で２時間インキュベートした。検量線より、相対蛍光ユニット（RFU）シグナルをｎMの遊離ローダミンに変換した。カスパーゼ活性のインダクショ ンユニットは誘導・非誘導細胞のRFUシグナルの比より計算した。カスパーゼ活性の増加は、誘導・非誘導細胞のRFUシグナルの差（ΔRFU）として分析 された。

図２はカンプトテシンによるU９３７細胞中のカスパーゼ活性のカイネティックスを示しています。

図２． カンプトテシンによるU９３７細胞中のカスパーゼ活性のカイネティックス（３８４ウェルプレート）。 U９３７細胞を様々な時間間隔において３７℃で、４μg/mlのカンプトテシンに露曝し、ホモジニアス カスパーゼアッセイで分析した。蛍光強度を時間に対してプロットした。

ホモジニアス カスパーゼアッセイは、アポトーシスの謎を系統的に解明しようとする研究者にとって、大変有用なツールです。
このワンステップ技術は特にハイスループットスクリーニング（ＨＳＴ）に至適化されています。

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製品名	製品番号	包装単位	希望価格
ホモジニアス カスパーゼアッセイ	3005372	100アッセイ	¥40,600
	2236869	1000アッセイ	¥234,000

詳細はインターネットで!!→ http://biochem.roche.com/appotosis