従来のPCRプロトコールのライトサイクラーへの応用

ライトサイクラー コーナー

　定量的PCRが発展し、内部コントロールが導入されてより、その正確性における 信頼は飛躍的に高まりました。これ以来、この分析システムは多くの改良がなされましたが、それは増幅産物の分析の点に限られていました。ライトサイクラー は、PCR反応ステップにおける初めての改良で、45サイクルの増幅に必要な時間は30分より少なくてすみます。
そのPCRの迅速さと、PCR産物のオンライン分析が可能という利点より、従来のブロックサイクラーからライトサイクラーへの、乗換えの気運が高まって います。この場合もっとも考慮すべき点は、従来の溶液をベースとしたPCRでのプライマーが、ライトサイクラーのガラスキャピラリーでも使用できるかどう かという事です。もし、再デザインしなければならないとしたら、新たに多くの労力が必要となります。今回35セットのプライマーを、ライトサイクラーでの 増幅に使用しました。

ライトサイクラーで使用可能なプライマー
ヒト サイトカイン		マウス サイトカイン
IL-2 IL-10 IFNγ IL-1β TNFα	IL-6 MIP-1α iNOS IL-12p40 IL-1ra	IL-2 IL-10 IFNγ IL-1β IL-6	TNFα MIP-1α
ヒト ハウスキーピング遺伝子		レポータージーン
β2-ミクログロブリン α-アクチン CD33 CD14		GFP(エンハンスド) ルシフェラーゼ β-ガラクトシダーゼ ネオマイシン
ヒト 成長因子/オンコジーン		HIVジーン
ErbB-2 EGFr TGFα		pol #1 pol #3 gag #6
ライトサイクラーで使用不可能なプライマー
ヒト		マウス
IL-4		IL-4

表1. ヒト及びマウス遺伝子よりの分子で試験されたプライマーセット。すべてのプライマーセットはブロックサイクラーでの55℃のアニーリングに至適化されている。増幅産物のサイズ幅は、250-500 bpである。

ライトサイクラーではPCRバッファーが異なりますので、最初にMg2+濃度を2.0-5.0 mMの範囲で変え、LightCycler DNA Master SYBR Green Iキットを用いてPCRを行い、検討しました。ブロックサイクラー用のプライマーセットは55℃で至適化されていますので、ライトサイクラーでの条件決めも55℃で行いました(表2参照)。

	ブロックサイクラー	ライトサイクラー
初期の変性	0 s 94℃	0 s 94℃
変性 アニーリング 伸長	30 s 94℃ 60 s 55℃ 30 s 72℃	0 s 94℃ -20°/s ランプ 2 s 55℃ -20°/s ランプ 10 s 72℃ -2°/s ランプ

表1.サーマルサイクラーの条件。

ライトサイクラーでのPCR産物をゲル電気泳動で検討した結果、次の4種類の結果が観察されました。 1) プライマーセットは、Mg2+に感受的であった(図1. レーン7-10)。 2) プライマーセットは、Mg2+に感受的で無かった(図1. レーン3-6)。 3) プライマーセットはライトサイクラーで、より効率的に作動した(図1. レーン1と2) 4) ブロックサイクラーで増幅できたプライマーセットは、ライトサイクラーでは増幅しなかった(表1)。

図1．ライトサイクラーとブロックサイクラーで増幅されたPCR産物のEtBr染色アガロースゲル分析。 ライトサイクラーで45サイクル後、キャピラリーチューブを1.5 mlエッペンドルフチューブに逆さまに入れ、マイクロ遠心機で軽く遠心した。20μlのPCR産物中の10μlを3% アガロースで電気泳動し、EtBrで染色した。 レーン1： ブロックサイクラーよりのhIL-12p40、 レーン2： 最終Mg2+濃度4 mMでのLCよりのhIL-12p40、 レーン3： 最終Mg2+濃度2 mMでのLCよりのhTGFα、 レーン4： 最終Mg2+濃度3 mMでのLCよりのhTGFα、 レーン5： 最終Mg2+濃度4 mMでのLCよりのhTGFα、 レーン6： 最終Mg2+濃度5 mMでのLCよりのhTGFα、 レーン7： 最終Mg2+濃度2 mMでのhMIP-1α、 レーン8： 最終Mg2+濃度3 mMでのhMIP-1α、 レーン9： 最終Mg2+濃度4 mMでのhMIP-1α、 レーン10： 最終Mg2+濃度5 mMでのhMIP-1α。 hIL-12p40のアンプリコンは397 bp、hTGFαのアンプリコンは369 bp、hIMP-1αは379 bpである。レーン1-2のテンプレートは刺激ヒトPBMC cDNA、レーン3-6のテンプレートは口腔粘膜生検cDNA、レーン7-10のテンプレートはDNAコンペティタープラスミドHMPC1.2用である。MWMは分子量マーカー。 結果： テストした35のプライマーセットの内、32は最初のスクリーニングで作動しました。残りの3個の内、1つはアニーリング温度を50℃にする事により作動 しました。残りの2つはまったく作動しませんでした。結論として35の内33のプライマーセットが、最少の労力でライトサイクラーに変換できました。

ライトサイクラー V3・システム－リアルタイム・マルチカラー検出の可能性

マルチカラー検出－ライトサイクラーソフトウエアVer.3とLC Red 750 ライトサイクラーは定性および定量的PCR用の画期的なシステムとして、発売以来、大変なご高評をいただいております。現在までソフトウエアの制限によ り、デュアルカラー検出までしか行えませんでした。PCR産物の定量や、融解曲線分析によるポイントミューテーションの同定には、デュアルカラー検出で十 分ですが、より複雑な分析のためのマルチカラー検出が望まれていました。 今回、新規の蛍光標識試薬LightCycler-Red 705 ホスフォアミダイトと、バージョンアップしたソフトウエア Ver.3により、リアルタイム・マルチカラー検出およびオンラインPCR分析が可能となりました。 チャンネル1：530 nm－SYBR Green I及びフルオレセイン検出 チャンネル2：640 nm－LC-Red 640検出 チャンネル3：710 nm－LC-Red 705検出 マルチカラー検出により、更なるパフォーマンスが行えます。 ● インターナルコントロールとしての使用(PCRの阻害を除外) ● 1サンプル中の複数の配列を検出 ● 複合的なミューテーションの検出 ● インターナルスタンダードによる、より正確な定量フォーマットの開発 マルチカラー検出によるミューテーションの検出 　ライトサイクラーシステムにおけるミューテーションの検出は、ハイブリダイゼーションプローブの一本鎖DNAへの温度特異的ハイブリ ダイゼーションをモニターする、メルティングカーブ分析で行います。ミューテーションがある場合、ハイブリダイゼーションプローブとのミスマッチにより、 メルティング温度(Tm)が低くなります。 ミューテーションは、多くの場合疾患の原因となります。ある種の場合、例えば第V因子ライデンミューテーションは単一のポイントミューテーションですが、 またいくつかの多型的部位が疾患を引き起こす例があります。HFE遺伝子はその一例で、遺伝子内のCys28TyrとHis63Aspの位置で多型的部位 が見られます。この場合では2つのミューテーションは離れたエキソンに存在しますので、マルチプレックスPCRが要求されます。他の遺伝子は単一のエキソ ンに2種類のミューテーションを持つ事が知られています。 ライトサイクラーのマルチカラー検出ユーティリティの効果を見るため、同一のキャピラリー内で1遺伝子上の2種類のポイントミューテーションを同時分析できる、モデルシステムを確立しました。   実験的アプローチ ポジションAの分析にはLC-Red 640標識プローブ、ポジションBの分析にはLC-Red 705標識プローブを用いました。 図1. 遺伝子分析のスキーム。増幅断片は265 bpにわたる。2セットのハイブリダイゼーションプローブは約100 bp離れており、それぞれの部位に特異的である。両方のミューテーションは同じアンプリコンに存在する事に注意。 増幅反応後直ちにメルティングカーブ分析を行いました。PCR産物を30秒変性した後、同じサンプルを42℃ まで冷却し、2分間この温度を保持します。次にサンプルを80℃まで徐々に熱し(上昇率は0.1℃/秒)、その間の蛍光を測定しました。データは直ちに ディスプレイに現われ、保存されます。 結果 ライトサイクラーソフトウエアで、メルティングカーブ分析を行いました。予備実験として次の3種類の異なるミクスチャーサンプルを用い、条件設定を行いました。

ポジションA(LC Red 640)				ポジションB(LC Red 705)
No.	タイプ	対立遺伝子	配列	No.	タイプ	対立遺伝子	配列
1	ホモザイガス ワイルドタイプ	wt/wt	CGC/CGC	4	ホモザイガス ワイルドタイプ	wt/wt	CGC/CGC
2	ヘテロザイガス	wt/mut	CGC/TGC	5	ヘテロザイガス	wt/mut	CGC/TGC
3	ホモザイガス ミュータント	mut/mut	TGC/TGC	6	ホモザイガス ミュータント	mut/mut	TGC/TGC

メルティングピークを用いて、ポジションAのジェノタイピングは容易に決定されました(チャンネル2)。ポジションBのLC-Red 705のメルティングカーブ(チャンネル3)はLC Red 640の蛍光シグナルの影響により、はっきりと分析できませんでしたが(図3E)、下記の通り色較正ファイル(CCF)をアクティブにする事で補正され(図3F)、明瞭な分析が可能となりました。 図3. マルチカラー検出ソフトウエアを使用してのメルティングカーブ分析のスクリーンショット マルチカラー検出における蛍光補正 3種類の蛍光色素は、それぞれのエミッションの"クロストークザインされていますが、最小限のクロストークを完全に除去する事は出来ません。また機器そ れぞれの微妙な個性の違い(光学フィルター、レンズ、ミラーなど)により、クロストーク価に変動があります。これらのクロストークは、カラー コンペンゼーションキット(Cat.No. 2158850)により、機器毎の色較正ファイル(CCF)を作成する事で、完全に補正できます。 蛍光色素のエミッション強度ならびにスペクトラムは、温度に強く依存します。それゆえ、PCR実行中のデータ集積の温度は、クロストークに大きく影響しま す。これは特に融解曲線の分析などの、様々な温度で測定を行うアプリケーションで重要です。この温度依存性の変動も、色較正ファイル(CCF)で補正可能 です。

製品名	製品番号	包装単位
LightCycler-Red 705ホスフォアミダイト	2157594	1バイアル (0.2μmolスケールのオリゴヌクレオチドを10回ラベル)
LightCyclerカラーコンペンゼーションキット	2158850	5回キャリブレーション用セット
LightCyclerコントロールキットDNA(マルチカラーコントロール)	2158833	50回コントロール反応
LightCyclerコントロールキットRNA(マルチカラーコントロール)	2158841	50回コントロール反応

パラメーター特異的キット

ロシュ・ダイアグノスティックスでは、ライトサイクラーでのパラメーター特異的キットを開発し、鋭意その数を増やしております。まず、遺伝子のミューテーションを検出するキットを販売致します。

ライトサイクラーTM 第5因子 ライデンミューテーション デテクションキット

本キットはヒト第5因子遺伝子中の1691位のシングルポイントミューテーション(G→A)を、ライトサイクラーとハイブリダイゼーションプローブを用いて、検出します。このミューテーションは第5因子ライデンの原因とされます。

キット内には、プライマーと配列特異的検出用ハイブリダイゼーションプローブが、簡便なプレミックスタイプで供給されます。用意するものはテンプレートDNAだけです。

図. 第5因子ライデンミューテーションの、可能な3ジェノタイプのメルティングカーブ分析。蛍光vs温度の負の微分[-d(F2)/dT]グラフは、それぞれ のTmのピークを表す。融解ピークは、完全なホモロガス配列(ワイルドタイプのジェノタイプ)は、ミューテーションプローブによるミスマッチ配列より高い Tmを持つ事を示している。両方の配列(ヘテロザイガスジェノタイプ)を含むサンプルは、ホモザイガスサンプルと正確に同じ温度の、2つのピークを表示し ている。陰性コントロールはテンプレートの代りにPCRグレード蒸留水を使用。

キット内容

1. ライトサイクラーTM 第5因子 ライデンミューテーション デテクションミックス、10x 1バイアル、64μl;ヒト第5因子特異的ハイブリダイゼーションプローブミックスとready-to-useプライマーを含む 2. ライトサイクラーTM 第5因子 ライデン反応ミックス、10x 1バイアル、64μl;Taq DNAポリメラーゼ、反応バッファー 、dNTPミックス(dTTPの代りにdUTP)を含む 3. コントロールテンプレート 1バイアル、22μl; ヘテロザイガス プラスミドDNA 4. 蒸留水、滅菌、PCRグレード 1バイアル、1 ml

製品名 製品番号 包装単位 ライトサイクラーTM 第5因子 ライデンミューテーション デテクションキット 2212161 1キット(32回) 関連製品 製品番号 包装単位 ライトサイクラーTMプロトロンビン(G20210A) ミューテーション デテクションキット 2236842 1キット(32回) ライトサイクラーTM Apo B ミューテーション デテクションキット(コドン 3500) 3004708 1キット(32回) ライトサイクラーTM t(9;22) 定量キット 2207206 96反応(約30テスト)

MagNA Pure LC－全自動核酸精製装置

1998年にリアルタイム、オンラインPCRシステムであるライトサイクラーが導入されて以来、ライトサイクラーはオンライン検出と定量における迅速で正確、信頼性のあるPCR分析の同義語となりました。

MagNA Pure LCとライトサイクラーの組み合わせにより、全自動核酸精製はスピード、正確性、信頼性において、その高い水準にマッチします。その上ライトサイクラー キャピラリーを、ステージ上のアダプター内に、あるいはカローセル内に直接装着する事により、精製核酸とPCRマスターミックスを全自動で分注する事が出 来ます。また他のPCR機器で使用できるよう、PCR反応液を96ウェルPCRプレートに直接ピペッティングする事も出来ます。

MagNA Pure LCは全自動で柔軟性の高い、高品質の核酸精製のための、ライトサイクラーシステムの上流に位置するコンポーネントです。簡単で至適化された核酸精製プロトコールが、使いやすいソフトウェアで供給されます。

写真 図1. MagNA Pure LC (前面)

磁性体粒子テクノロジーを使用してのハイスピード核酸精製 サンプルの取扱いの柔軟さ ■ 血液、組織、細胞あるいはそれ以外のサンプルからのDNA、RNA、mRNAの精製 ■1-32サンプルから1ラン、40分以内に精製 ■ ヌクレオチド及びPCR試薬をライトサイクラーキャピラリーや96ウェルマイクロタイタープレートにロード 真の全自動プロセス機器 ■すべてのプロセスはソフトウェアでコントロール ■ チップ詰まりによる損失を自動検出 ■ 途中操作や遠心ステップは必要としない 高品質の核酸 ■ 磁性体粒子テクノロジーにより80%の回収を達成 ■ 高純度：OD260：280 > 1.9によりアッセイの性能が効率アップ ■ クロスコンタミネーション無し ライトサイクラー用に特にデザイン ■ ライトサイクラーでの応用と統合的にセットアップ ■ LCキャピラリーやカローセルにPCR反応液を全自動分注 ■ データやサンプルIDをMagNA Pure LCからLCソフトウェアへ転送

MagNA Pure LCからLCソフトウェアへのデータの自動転送：

MagNA Pure LCのすべての機能と精製プロトコールの全ステップは、ウィンドウNT上のソフトウェアでコントロールされます。すべてのサンプル情報とデータは、PCR増幅の開始前にMagNA Pure LCからライトサイクラーへ転送可能です。

図2. MagNA Pure LC ソフトウェア。メインメニューのスクリーンショット

精製用キット(DNA, RNA, mRNA用)：

図3. MagNA Pure LC mRNA アイソレーションキット

MagNA Pure LCはライトサイクラーにも至適化された、キットと共に使用します。これらのキットは、幅広い核酸の精製アプリケーションに必要な試薬をすべて含んでいます。

■ MagNA Pure LC DNAアイソレーションキット
血液、培養細胞、凍結組織からのDNAの分離
■ MagNA Pure LC RNAアイソレーションキット
白血球、末梢血リンパ球、培養細胞および組織切片からのトータルRNAの精製
■ MagNA Pure LC mRNAアイソレーションキット
白血球、末梢血リンパ球、培養細胞および組織切片からのmRNAの精製

ディスポ器具：
便利でヌクレアーゼフリーのディスポ製品を取り扱っています。クロスコンタミネーションフリーで、完全な核酸を保証します。
■ MagNA Pure LC 反応チップ (ラージ、スモール)
■ MagNA Pure LC 試薬タブとフタ (ラージ、スモール)
■ MagNA Pure LC プロセッシングカートリッジ
■ MagNA Pure LC サンプルカートリッジ

新製品コーナー

Anti-HA アフィニティマトリックス－リコンビナントタンパクの分離・精製に

低発現量のHA-タグ リコンビナントタンパク質の検出

新製品のAnti-HA アフィニティマトリックスを用いる事で、タグ リコンビナントタンパク質を高感度でしかも特異的に精製する事が出来ます。この抗体(クローン 3F10)は、ヒトインフルエンザ・ヘマグルチニン(HA)タンパク質の9-アミノ酸配列を、最も高い親和性で認識します。

Anti-HA アフィニティマトリックスは、哺乳類細胞、酵母、バクテリア細胞の抽出物からHA-タグタンパク質を免疫沈降させたり、アフィニティ精製するために使用さ れます。免疫沈降や精製に続き、ウェスタンブロットやシルバーステインでタグタンパク質を分析します。

図1.HAタグホスフォリパーゼA(37 kD)の弱い発現を示す、ステーブルなトランスフェクト、マウスIa細胞のライセート(トータルプロテイン1 mg/ml)のウェスタンブロット。
レーン1：免疫沈降前に2：1に希釈
レーン2：免疫沈降前に2：1に希釈
レーン3：免疫沈降前に2：1に希釈

Anti-HA アフィニティマトリックスで可能な事：

■ HAタグ融合タンパクへの迅速な結合
■ 低発現タンパク質の検出(図3)
■ バクテリア、哺乳類細胞、酵母の発現システムでのバックグランドの除去(図4)
■ 煩雑で時間のかかる至適化ステップが避けられる

Anti-HA ハイアフィニティ抗体の特異性と感度

ロシュ・ダイアグノスティックスでは、エピトープタギングに必要な試薬を幅広く提供しています。新製品のAnti-HA ハイアフィニティ抗体(クローン 3F10)には、ビオチン、フルオレセイン、PODを標識したものも発売されます。
■ POD標識Anti-HA、ハイアフィニティ 直接検出により、ウェスタンブロットにおいてイムノグロブリンの結合とバックグランドを回避します。
■ フルオレセイン標識Anti-HA、ハイアフィニティ ワンステップフローサイトメトリーが行え、細胞のバックグランド染色を減少させ、細胞内の局在の感度を上げます。
■ ビオチン標識Anti-HA、ハイアフィニティ ウェスタンブロットや免疫組織染色での、2種類の抗原の同定に使用します。検出系は広い範囲で、酵素および蛍光標識ストレプトアビジンが選べます。

製品名 製品番号 包装単位 Anti-HA、アフィニティマトリックス Anti-HA、ハイアフィニティ(3F10) 18674231867431 50μg500μg POD標識Anti-HA、ハイアフィニティ(3F10) 2013819 25 U フルオレセイン標識Anti-HA、ハイアフィニティ(3F10) 1988506 50μg ビオチン標識Anti-HA、ハイアフィニティ(3F10) 2158167 50μg 関連製品名 製品番号 包装単位 pHB6 バクテリア発現ベクター(N-HA+His6-C) 1814575 20μg pBH バクテリア発現ベクター(HA-C) 1814605 20μg pHM6 哺乳細胞発現ベクター(N-HA+His6-C) 1814664 20μg pMH 哺乳細胞発現ベクター(HA-C) 1814702 20μg Anti-HA(12CA5) 15838161666606 200μg 5 mg/1 ml POD標識Anti-HA(12CA5) 1667475 50μg(500μl) マルチ-タグ マーカー 1828649 250 μl Lumi-LightPLUS POD ウエスタンブロッティング キット(マウス/ウサギ) 20152181000 cm2メンブレン Complete,(プロテアーゼインヒビターカクテル錠) 1697498 20錠

TROPIXの新製品！！
Luc-Screen™－発光持続型ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ キット

迅速でシンプルなフォーマット

Luc-Screenは、ハイスループットスクリーニングに最適な、便利で使いやすいルシフェラーゼアッセイシステムです。このシステムには、マイ クロタイター上の培養液中の細胞に加える、2種類の試薬が含まれ、フェノールレッドの有無に関わらず使用できます。最初の10分間のインキュベーションで 細胞が溶解され、この間に光シグナルはプラトーに達します。発光シグナルは4－5時間の半減期で持続するため、試薬の添加から測定までに十分な時間の余裕 があります。

図

高感度で広いダイナミックレンジ

ホタルルシフェラーゼは、もっとも高感度なレポーター酵素の一つです。Luc－Screenシステムでは50 fg以下のルシフェラーゼでも検出できます。高感度なだけでなく広いダイナミックレンジで測定できます。Luc－Screenシステムでは50 fgから100 ngの間で直線的なシグナルが得られます。ダイナミックレンジは6桁以上です。

グラフ

Luc－Screenの感度を示します。清々ルシフェラーゼの希釈系列をDMEMで調製し、Luc－Screenを用いてアッセイを行いました。 TR71マイクロプレートルミノメーターで、ウェル当たり0.1秒間シグナルを測定しました。Luc0Screenの6桁以上(50 fgから100 ng)にわたるダイナミックレンジが示されています。

製品名 製品番号 包装単位 Luc-Screen LS200
LS1000 200回反応
1000回反応

Gal-Screen™－哺乳類細胞、酵母のレポータージーンアッセイに

迅速でシンプルなフォーマット

Gal-Screenは、基質をバッファーA(哺乳類細胞用)あるいはB(酵母用)に加えるだけで、細胞溶解から反応までのすべての成分を含む、試薬溶液 が調製できます。後は、96ウェルあるいは384ウェル上の培地中の細胞に等量加えインキュベーションするだけです。その後、ルミノメータで発光を測定し ます。

Gal-Screenのフォーマット

Gal-ScreenTMアッセイのカイネティックス

Gal-ScreenアッセイはΨ2-BAGα細胞(β-ガラクトシダーゼの発現を構築した安定トランスフェクションNIH/3T3細胞、 10,000細胞/ウェル)及び、トランスフォーム酵母細胞(Gal4 WT; 23,000細胞/ウェル)を用いて行われた。Ψ2-BAGα細胞は反応バッファーAとBで分析、酵母細胞は反応バッファーBで分析した。プレートは TR717マイクロプレートルミノメーターで繰り返し測定される間27℃でインキュベーションされた。データは最大発光シグナルうに対する%で表示。

高感度で広いダイナミックレンジ

Gal-Screenは1 pgのβ-ガラクトシダーゼ(培地中)を検出し、他のレポータージーンアッセイシステムに比べ優れた感度を示します。ダイナミックレンジも5桁のワイドレンジを持っています。

製品名 製品番号 包装単位 Gal-Screen(哺乳類細胞用) GSM200
GSM1000 200回反応
1000回反応 Gal-Screen(酵母用) GSY200
GSY1000 200回反応
1000回反応

ワンステップイースト（酵母）用溶解剤

上記Gal-Screen（酵母用）中のワンステップ溶解剤を別売しております。

製品名 製品番号 包装単位 One-Step Yeast Lysis Buffer ABX150LD 150 ml (1800MTPアッセイ)

cAMP-Screen
cAMP濃度測定用化学発光イムノアッセイキット

cAMP-Screenイムノアッセイキットは、細胞溶解液中のcAMP濃度を高感度で測定します。このシステムは競合イムノアッセイを利用し、マニュア ルにも、自動化されたハイスループットスクリーニングにも対応できる、柔軟なシステムです。cAMP-Screenアッセイで採用されている化学発光検出 は、最も高感度で広いダイナミックレンジを持ち、60フェムトモルから6ナノモルまでのcAMP量を、サンプルの希釈やアセチル化などの処理をせずに測定 できます。

cAMP-Screenアッセイフォーマット

キット内容(192回用と960回用)

1.アッセイ/溶解バッファー 25 ml/2 x 65 ml 2.スタンダードストック溶液 2 ml/2 x 5 ml 3.抗cAMP抗体 14 ml/2 x 35 ml 4.AP標識cAMP 100μl/2 x 250μl 5.標識物希釈バッファー 10 ml/2 x 25 ml 6.洗浄バッファー 500 ml/2 x 1000 ml 7.CSPD/Sapphire II ready-to-use 25 ml/2 x 65 ml 8.コート済み96ウェルプレート 2プレート/10プレート

製品名 製品番号 包装単位 cAMP-Screen CS200
CS1000 192回反応
960回反応

プロベリアTM －PCRによる微生物の検出キット

プロベリア(PROBELIA)は、SANOFI DIAGNOSYTICS PASTEUR社のPCR-食品テストキットで、下記の原理で微生物の存在を検出します。

[原理図]

1.抽出	25gの食品サンプルと225 mlの平衡化ペプトン水37℃で18±2時間	遠心	溶解	ヒートブロック	遠心
		12000 rpm 2分間	200μl 溶解試薬 ボルテックス ペレット	56℃ 15分間 ボルテックス 100℃ 8分間 ボルテックス	12000 rpm 2分間	上澄中抽出DNA 生卵の場合、1/100希釈

	PCR反応				サーマルサイクラー	変性
3.検出	90μl増幅ミックス	100μl DNAサンプル	コントロール+ 10μl	コントロール－ 10μl		100μl 変性試薬

H1 サルモネラ	6回洗浄(H4 1/10)	再水酸化の後、ウェルを空ける ハイブリダイゼーション37℃で1時間振とう 発色反応 H5+H6200μl 37℃ 30分 停止溶液 H7 100μl	H0 インターナルコントロール 6回洗浄(H4 1/10)
450/620 nmで測定 ↓ 結果の評価

プロベリアTMサルモネラ キット	製品番号	包装単位
サルモネラ遺伝子増幅キット サルモネラ検出キット	489915 489922	96テスト 96テスト
Salmonella 属検出用試薬	NEW

背景

Salmonella 属による食中毒の発生状況はここ数年増加しています。その原因となる食材は、生卵と卵加工品、食肉が主なものです。Salmonella 属の血清型は、2,000以上ある事が確認されており、潜在的にその全てが、ヒトに対して病原性を持ちます。

PCR法によるプロベリアTM サルモネラ キットでの検査結果は、増菌培養後24時間以内に得られ、他法と比較して検出感度も良好で、多数検体の検査も容易です。またPCR反応を阻害する物質の存 在を確認するため、内部コントロールを平行して測定する事で、偽陰性効果を知る事が出来ます。

キットの内容
1. サルモネラ遺伝子増幅キット

試薬	試薬名	包装
A1	遺伝子抽出試薬	22 ml x 1ボトル
A2	遺伝子増幅試薬	2.5 ml x 4チューブ
A3	PCR陽性コントロール	0.5 ml x 1チューブ
A4	PCR陰性コントロール	1.0 ml x 1チューブ
A5	タンパク質変性試薬	12 ml x 1ボトル

2. サルモネラ検出キット

試薬	試薬名	包装
H0	内部コントロール特異プローブ固相マイクロプレート	8ウェルx12ストリップ
H1	サルモネラ遺伝子特異プローブ固相マイクロプレート	8ウェルx12ストリップ
H2	ハイブリダイゼーション緩衝液	100 ml x 1ボトル
H3	POD標識サルモネラ/内部コントロール特異プローブ	0.3 ml x 1チューブ
H4	洗浄液、x10	100 ml x 1ボトル
H5	基質/緩衝液	60 ml x 1ボトル
H6	発色剤	1 ml x 1ボトル
H7	反応停止液	28 ml x 1ボトル

付属品: マイクロプレート粘着フィルム(20枚)

プロベリアTM リステリア モノサイトゲネス キット	製品番号	包装単位
リステリア モノサイトゲネス遺伝子増幅キット リステリア モノサイトゲネス検出キット	489939 489946	96テスト 96テスト
Listeria monocytogenes 検出用試薬	NEW

背景

リステリア属には6種の菌が属しており、この中ではListeria monocytogenesだけがヒトに対して病原性があります。汚染された食物や水を摂取して感染しますが、肉、海産物、乳製品や野菜などが食中毒の多くの原因です。

PCR法によるプロベリア™ キットでの検査結果は、増菌培養後24時間以内に得られ、他法と比較して検出感度も良好で、多数検体の検査も容易です。またPCR反応を阻害する物質の存 在を確認するため、内部コントロールを平行して測定する事で、偽陰性効果を知る事が出来ます。

キットの内容
1. モノサイトゲネス遺伝子増幅キット

試薬	試薬名	包装
A1	遺伝子抽出試薬	22 ml x 1ボトル
A2	遺伝子増幅試薬	2.5 ml x 4チューブ
A3	PCR陽性コントロール	0.5 ml x 1チューブ
A4	PCR陰性コントロール	1.0 ml x 1チューブ
A5	タンパク質変性試薬	12 ml x 1ボトル

2. リステリア モノサイトゲネス検出キット

8ウェルx12ストリップ

試薬	試薬名	包装
H0	内部コントロール特異プローブ固相マイクロプレート
H1	リステリア モノサイトゲネス遺伝子特異プローブ固相マイクロプレート	8ウェルx12ストリップ
H2	ハイブリダイゼーション緩衝液	100 ml x 1ボトル
H3	POD標識リステリア モノサイトゲネス/内部コントロール特異プローブ	0.3 ml x 1チューブ
H4	洗浄液、x10	100 ml x 1ボトル
H5	基質/緩衝液	60 ml x 1ボトル
H6	発色剤	1 ml x 1ボトル
H7	反応停止液	28 ml x 1ボトル

付属品: マイクロプレート粘着フィルム(20枚)

プロベリアTM 大腸菌 O-157: H7 キット	製品番号	包装単位
大腸菌 O-157: H7遺伝子増幅キット 大腸菌 O-157: H7検出キット	489953 489960	96テスト 96テスト
E. coli O157:H7 検出用試薬	NEW

背景

大腸菌(Escherichia coli) O157: H7は、食中毒を起こす原因菌の1つであり、食品中の存在を迅速に感度良く検出する事が、要求されています。食品の中では牛挽肉が感染源として高い頻度を示します。

PCR法によるプロベリアTM 大腸菌 O-157: H7 キットでの検査結果は、増菌培養後24時間以内に得られ、他法と比較して検出感度も良好で、多数検体の検査も容易です。またPCR反応を阻害する物質の存 在を確認するため、内部コントロールを平行して測定する事で、偽陰性効果を知る事が出来ます。

キットの内容
1. リステリア モノサイトゲネス遺伝子増幅キット

試薬	試薬名	包装
A1	遺伝子抽出試薬	22 ml x 1ボトル
A2	遺伝子増幅試薬	2.5 ml x 4チューブ
A3	PCR陽性コントロール	0.5 ml x 1チューブ
A4	PCR陰性コントロール	1.0 ml x 1チューブ
A5	タンパク質変性試薬	12 ml x 1ボトル

2. リステリア モノサイトゲネス検出キット

試薬	試薬名	包装
H0	内部コントロール特異プローブ固相マイクロプレート	8ウェルx12ストリップ
H1	大腸菌 O-157: H7遺伝子特異プローブ固相マイクロプレート	8ウェルx12ストリップ
H2	ハイブリダイゼーション緩衝液	100 ml x 1ボトル
H3	POD標識大腸菌 O-157: H7 /内部コントロール特異プローブ	0.3 ml x 1チューブ
H4	洗浄液、x10	100 ml x 1ボトル
H5	基質/緩衝液	60 ml x 1ボトル
H6	発色剤	1 ml x 1ボトル
H7	反応停止液	28 ml x 1ボトル

付属品: マイクロプレート粘着フィルム(20枚)

Tips & Facts

ゼブラフィッシュ発育中のサイトケラチン8(K8) mRNAの検出 －RT-PCRとホールマウント in situ ハイブリダイゼーションによる研究

Keywords: サイトケラチン、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、上皮マーカー、in situ ハイブリダイゼーション、RT-PCR

上皮細胞の細胞骨格ネットワークにおいて、サイトケラチンは中間フィラメントの主要な構造タンパク質です。30以上のサイトケラチンが同定されていますが、ケラチン8(K8)は発育中に発現する最初の中間フィラメントです。我々は最近透明な胚を持ち、直接in situハイブリダイゼーションで遺伝子発現を観察できる、ゼブラフィッシュでサイトケラチン8をクローンしました。この特徴を利用し、胚及び成魚のzf-K8 mRNAの発現を、DIG RNAラベリングキットを用いて、ホールマウントや胚及び成魚のパラフィンや凍結切片のin situハイブリダイゼーションで、分析しました。mRNAの分析はまた、Titan™ RT-PCRシステムを使用して、胚と成魚の組織よりのトータルRNAのRT-PCRで行いました。

ハイブリダイズしたPCR産物の図1で見られる通り、zf-K8の転写産物は胚、成魚の皮膚、小腸で予想通りの580 bpバンドとして現れました。増幅を増やした時(20サイクル)、卵巣と脳でzf-K8 mRNAの発現が示され、皮膚、小腸、成魚の脳で高分子(850 bp)のフォームが現れました。

図1. RT-PCR産物のハイブリダイゼーションによるzf-K8発現の検出。zf-K8へのホモロガスオリゴプローブがハイブリダイズしたRT-PCR断片のオートラジオグラフ。
上部パネル： PCR増幅10サイクル(x10)。下部パネル：PCR増幅20サイクル(x20)。
レーン(左から右)：1-卵巣、2-長楕円/球形ステージ胚(4 hpf)、孵化胚( 52 hpf)、4-5-6-成魚由来の皮膚、小腸、脳。

zf-K8の場所的な発現パターンは、発育2 hpfから3日の胚のホールマウントin situ ハイブリダイゼーションにより実験されました。これにより、深度の違いはあれ発育胚の表面全体が常に染色され(図2)、ほとんどの表面細胞層が常にzf- K8を発現している事(図3,4)から、zf-K8遺伝子が胎生上皮のマーカーである事が分かりました。

図2. 野生型ゼブラフィッシュ胚でのzf-K8の時空間的発現。ホールマウント胚はDIG標識zf-K8アンチセンスRNAとハイブリダイズした。

A． 分割期(64細胞/2 hpf)。B. 球形/ドーム型期(約 4 hpf)。 C. 原腸胚期: 60% 被包期(6 hpf)。D. 90% 被包期(9 hpf)。E. 咽頭期: prim-15ステージ(30 hpf)、上部にin situ ハイブリダイゼーションの陰性コントロール(センスRNAプローブでハイブリダイズ)が見える。F. high-pec期(42 hpf)、胚前部の横面図。
スケール： A-D 200μm； E 250μm； F 150μm
略語： A = 頭部、 D = 背面、 m = 胚盤葉縁、 V = 腹面

図3. zf-K8プローブで染色したゼブラフィッシュ胚のパラフィン切片(20μm)。ホールマウントを切片化の前に、DIG標識zf-K8アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズした。染色は染色バッファーのアルカリ強度により、褐色か青色に着色した。
A. 90% 被包期(9 hpf)。 B. 90% 被包期の詳しい観察。 C.咽頭期: prim-15ステージ(30 hpf) の眼と中脳部のトランスバース切片。 D. 30 hpf胚の軸索部分のトランスバース切片。
スケール： A 150μm； B 15μm； C 60μm； D 75μm

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
DIG RNAラベリングキット	1175025	2 x 10回反応
Titan ワンチューブRT-PCRシステム	1888382 1855476	25回反応 100回反応

略語： dc = DEL細胞、 ec = EVL細胞、 e = 眼、 i = 内部染色細胞層、 m = 体性筋、 s = 軸索、 p = 包皮、 y = 卵黄

FuGENE 6トランスフェクション試薬によるラット海馬ニューロンのトランスフェクション

分離培養された初代ニューロンは、分化、生存、過程的成長、シナプス生成などの神経現象を研究する際の有用なモデルです。ただ細胞が分裂の後で、培 養条件に敏感なため、培養ニューロンへの遺伝子導入には、まだまだ問題があります。リン酸カルシウム法やリポソーム方などの従来の方法は、毒性があり ニューロンに害があります。その上細胞毒性のため、効率も大変に低くなります。今回、FuGENE 6トランスフェクション試薬が初代ニューロンのトランスフェクションに最適であるという事が分かりました。この試薬の初代海馬ニューロンのトランスフェク ション効率は、他の細胞に比べ低い(1-2 % vs. 継代神経腫細胞株で約50%)ものですが、単一のニューロン研究には十分です。またこの実験条件下では、FuGENE 6は海馬ニューロンに対して毒性を現しませんでした。

トランスフェクションのプロトコール

1. 滅菌エッペンドルフチューブ内に97μlの無血清培地(添加剤としてGlutamax Iのみを含むDMEM)と3μlのFuGENE 6トランスフェクション試薬を加え、5分間インキュベートする。常に氷上に静置。
2. 別の滅菌エッペンドルフチューブに3μgのDNAを加える。ここに100μlの希釈したFuGENE 6トランスフェクション試薬を1滴ずつ加え、タッピングで混合する。
3. 室温で15分間インキュベートする。このDNAミックスを1適ずつ細胞に加える。渦を巻くように混合する。
4. 10% CO2環境の湿式インキュベーターに、37℃で3時間静置する。
5. 3時間後、DMEM培地を除去し、Neurobasalメディウムと入替える。
6. 希望の時間まで培養する。

トランスフェクト細胞の検出法

希望の時間培養したのち、ニューロンをPBS、pH 7.3で洗浄する。ニューロンを室温で20分間、4%のパラホルムアルデヒドで固定する。カバースリップをSlowFadeマウンティングメディウムでマウントした後、蛍光顕微鏡で観察した。

結果
我々は、FuGENE 6トランスフェクション試薬によるラット海馬ニューロンのトランスフェクションに成功しました。

図1Aは、8日間 in vitro培養(DIV)したE 17ラット海馬ニューロンを、MAP5抗体(赤)で染色したものです。核はDAPI(青)で染色されています。図1Bは、FuGENE 6トランスフェクション試薬でのトランスフェクトでGFP(緑)を発現している8日間培養の、単一の海馬ニューロンを示しています。 図1. FuGENE 6トランスフェクション試薬による、初代ラット海馬ニューロンのトランスフェクション。1A: MAP5抗体(赤)で染色した、8日間 in vitro培養(DIV)したE 17ラット海馬ニューロン。核はDAPI(青)で染色されている。1B. FuGENE 6トランスフェクション試薬でのトランスフェクトでGFP(緑)を発現している8日間培養の、単一の海馬ニューロン。

製品名	製品番号	包装単位	希望価格
FuGENE 6トランスフェクション試薬	1815091 1814443 1815075	0.4 ml 1 ml 5 x 1 ml

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